Combining xenium in situ spatial transcriptomics and imaging mass cytometry on a single tissue section

Diese Studie stellt einen neuartigen Workflow vor, der Xenium in situ und Imaging Mass Cytometry auf einer einzigen Gewebeprobe kombiniert, um durch die Integration von RNA- und Protein-Daten auf Einzelzell-Ebene ein umfassenderes Verständnis komplexer zellulärer Landschaften zu ermöglichen.

Das Wesentliche

Stellen Sie sich vor, Sie versuchen, ein riesiges, lebendiges Stadtviertel zu verstehen. Um es wirklich zu begreifen, brauchen Sie zwei verschiedene Arten von Informationen:

1. Die Pläne: Was sollte dort passieren? (Das sind die genetischen Anweisungen, die RNA).
2. Die Realität: Was tut tatsächlich gerade? (Das sind die Proteine, die die eigentliche Arbeit verrichten).

Bisher mussten Wissenschaftler für diese beiden Aufgaben zwei getrennte Fotos machen: eines für die Pläne und eines für die Realität. Das Problem dabei: Wenn man zwei Fotos von zwei fast identischen, aber nicht exakt gleichen Straßenabschnitten macht, stimmen die Details nicht überein. Man weiß nicht genau, ob die Person auf Foto A dieselbe ist wie auf Foto B.

Die neue Entdeckung: Ein Super-Foto für beides

In diesem Papier beschreiben Forscher aus Sydney eine geniale neue Methode, die wie ein Zweikammer-Kamera-Objektiv funktioniert. Sie haben es geschafft, zwei hochmoderne Technologien – Xenium (für die RNA-Pläne) und IMC (für die Protein-Realität) – auf ein und dasselbe Stück Gewebe anzuwenden.

Hier ist die einfache Erklärung, wie das funktioniert und warum es wichtig ist:

1. Das Experiment: Ein Tanz auf einem Seil

Stellen Sie sich das Gewebestück (ein winziges Stückchen von einem Melanom-Tumor) als einen sehr empfindlichen Tanzboden vor.

• Schritt 1 (Xenium): Zuerst betreten die "RNA-Scanner" den Boden. Sie scannen Tausende von genetischen Anweisungen, um zu sehen, welche Zellen welche Pläne haben. Dabei werden sie sehr vorsichtig, aber sie berühren den Boden.
• Schritt 2 (IMC): Danach kommen die "Protein-Scanner". Normalerweise würde man denken: "Oh, der Boden ist jetzt schon abgenutzt, die zweite Gruppe wird ihn ruinieren!"
• Das Ergebnis: Die Forscher haben bewiesen, dass der Tanzboden nach dem ersten Scan immer noch stabil ist! Die zweite Gruppe kann ihre Arbeit machen, ohne dass das Gewebe zerfällt oder die Farben verblassen. Es ist, als ob man nach dem ersten Foto sofort ein zweites, völlig anderes Foto von derselben Person machen könnte, ohne dass sie sich bewegt oder das Licht sie blendet.

2. Der große Unterschied: Pläne vs. Realität

Warum machen wir das überhaupt? Weil Pläne und Realität oft nicht übereinstimmen.

• Die Analogie: Stellen Sie sich einen Koch vor.
  • Die RNA ist die Einkaufsliste im Kühlschrank: "Wir wollen heute Pizza machen."
  • Die Proteine sind der Koch, der tatsächlich am Herd steht und die Pizza backt.
• Manchmal steht auf der Liste "Pizza", aber der Koch macht gerade nur Salat (weil er keine Zutaten hat oder müde ist).
• Wenn man nur die Liste liest (nur RNA), denkt man, es gibt Pizza. Wenn man nur den Koch sieht (nur Protein), sieht man Salat.
• Die Lösung: Nur wenn man beides gleichzeitig auf demselben Teller betrachtet, weiß man die wahre Geschichte: "Der Koch hat die Liste gesehen, aber noch nicht angefangen" oder "Er hat die Liste ignoriert".

3. Das Ergebnis: Bessere Karten für die Medizin

Die Forscher haben gezeigt, dass diese "Doppel-Scan"-Methode besonders bei Immunzellen (den Polizisten des Körpers) funktioniert.

• Wenn sie nur einen Scan nutzten, verpassten sie viele Details.
• Wenn sie beide Scans kombinierten, sahen sie genau, welche Immunzellen im Tumor aktiv sind und welche nicht.
• Das Wichtigste: Zellen, die beide Scans bestanden haben (also sowohl den Plan als auch die Tat zeigen), gaben die genauesten und nützlichsten Informationen über den Zustand des Tumors.

Warum ist das ein Durchbruch?

Bisher mussten Wissenschaftler raten, ob zwei Zellen auf zwei verschiedenen Gewebestücken wirklich dieselben waren. Mit dieser neuen Methode haben sie eine einzige, perfekte Landkarte, auf der man gleichzeitig lesen kann, was die Zelle denkt (RNA) und was sie tut (Protein).

Zusammengefasst:
Stellen Sie sich vor, Sie könnten ein Verbrechen aufklären. Früher mussten Sie sich zwei getrennte Zeugenaussagen anhören, die vielleicht von verschiedenen Orten kamen. Jetzt haben Sie ein Video, das sowohl das Geständnis (die Absicht) als auch die Tat (die Handlung) in Echtzeit zeigt. Das hilft Ärzten, Krankheiten wie Krebs viel besser zu verstehen und gezielter zu behandeln.

Technische Zusammenfassung

Technische Zusammenfassung: Kombination von Xenium-In-Situ-Spatial-Transkriptomik und Imaging Mass Cytometry (IMC) auf einem einzigen Gewebeschnitt

1. Problemstellung
Räumliche Omics-Technologien haben die Analyse von Gewebemikroumgebungen revolutioniert, indem sie hochplexige Profile von Proteinen und RNA-Molekülen in situ ermöglichen. Zwei führende Plattformen sind die Imaging Mass Cytometry (IMC), die bis zu 40 Proteinziele mit hoher Zuverlässigkeit für Phänotypisierungen erfasst, und Xenium (10x Genomics), eine neuartige Plattform für räumliche Transkriptomik, die bis zu 5000 mRNA-Ziele gleichzeitig messen kann.
Das Hauptproblem besteht darin, dass diese Technologien derzeit meist isoliert auf benachbarten Gewebeschnitten eingesetzt werden. Dies führt zu Problemen durch räumliche Variationen in der Zellzusammensetzung zwischen den Schnitten. Zwar existieren kommerzielle Lösungen für die gleichzeitige Erfassung von RNA und Protein (z. B. CosMx oder Xenium Protein-Assay), diese sind jedoch auf vorvalidierte Subpanels beschränkt und erlauben keine maßgeschneiderten Proteinpanels. Es fehlte bisher an einer etablierten Methode, um eine hochflexible, benutzerdefinierte Proteinanalyse (IMC) direkt auf demselben Gewebeschnitt nach einer Xenium-Transkriptomik-Analyse durchzuführen, ohne die Gewebeintegrität oder die Signalqualität zu beeinträchtigen.

2. Methodik
Die Autoren entwickelten einen neuartigen Dual-Plattform-Workflow, der Xenium und IMC auf einem einzigen formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitt kombiniert.

• Probenpräparation: Die Studie nutzte Gewebemikroarrays (TMA) mit Melanom-Proben aus Lymphknoten. Die Schnitte (5 µm) wurden auf Xenium-Gläser montiert.
• Xenium-Workflow: Zuerst wurde die räumliche Transkriptomik durchgeführt. Dies umfasste Deparaffinierung, Entvernetzung, Hybridisierung von Sonden (377 Gene), Ligation, Amplifikation und Autofluoreszenz-Quenching gemäß den Protokollen von 10x Genomics. Die Daten wurden im Xenium Analyzer erfasst.
• Post-Xenium IMC: Unmittelbar nach dem Xenium-Lauf wurde derselbe Gewebeschnitt (Slide A) für die IMC vorbereitet. Dies beinhaltete:
  • Antigen-Retrieval (unter Verwendung von Mikrowellen und pH 9,0 Puffer).
  • Blockierung und Färbung mit einem 40-plexen Panel aus metall-markierten Antikörpern (Tabelle 1 im Papier).
  • Färbung mit einem DNA-Interkalator (Ir-Intercalator) zur Kernmarkierung.
  • Erfassung mittels Hyperion Imaging System (Laser-Ablation und Time-of-Flight-Massenspektrometrie).
• Kontrollen: Ein benachbarter Schnitt (Slide B) wurde nach dem Xenium-Lauf mit H&E gefärbt, um die Gewebeintegrität zu prüfen. Ein weiterer Schnitt wurde nur mit IMC analysiert (ohne vorheriges Xenium), um die Signalqualität zu vergleichen.
• Datenintegration und Analyse:
  • Registrierung: Die Xenium- und IMC-Datensätze wurden manuell in Visiopharm registriert, indem 320 Landmarken auf entsprechenden Zellkernen (DAPI bei Xenium vs. DNA-Ir bei IMC) platziert wurden.
  • Segmentierung: Die Zellsegmentierungsmaske von Xenium wurde verwendet und auf die IMC-Bilder übertragen, um eine einheitliche Zellidentifikation zu gewährleisten.
  • Annotation: Zelltypen (T-Zellen, B-Zellen) wurden sowohl durch einfache Schwellenwertsetzung (einzelne Marker) als auch durch semi-überwachtes Clustering (FuseSOM) basierend auf multiplen Markern annotiert.
  • Konkordanzanalyse: Es wurde untersucht, wie viele Zellen von beiden Plattformen identifiziert wurden ("beide") im Vergleich zu nur einer Plattform ("nur Xenium" oder "nur IMC").

3. Wichtige Beiträge

• Erster Nachweis der Machbarkeit: Die Studie demonstriert erstmals die technische Durchführbarkeit, Xenium und IMC auf demselben FFPE-Gewebeschnitt durchzuführen.
• Validierung der Gewebeintegrität: Es wurde gezeigt, dass der komplexe Xenium-Workflow (inklusive mehrerer Hitzebehandlungen und chemischer Schritte) die Gewebestruktur nicht signifikant schädigt und nachfolgende IMC-Färbungen (inklusive Antigen-Retrieval) qualitativ hochwertig bleiben.
• Vergleichende Analyse der Diskrepanzen: Die Arbeit liefert detaillierte Einblicke in die Diskrepanzen zwischen RNA- und Protein-Expression auf Einzelzell-Ebene und zeigt, dass globale Korrelationen oft nicht auf Einzelzell-Ebene bestehen.
• Verbesserte Zell-Annotation: Die Studie belegt, dass die Integration beider Modalitäten (RNA + Protein) zu einer robusteren und biologisch aussagekräftigeren Identifizierung von Zellpopulationen führt als die Nutzung einer einzelnen Plattform.

4. Ergebnisse

• Gewebequalität: H&E-Färbungen und visuelle Vergleiche der Kernbilder (DAPI vs. Ir) bestätigten, dass das Gewebe nach dem Xenium-Workflow intakt blieb. Die Signalintensität der IMC-Marker (z. B. SOX10 für Tumorzellen, CD45 für Immunzellen) war nach dem Xenium-Workflow mit der von reinen IMC-Experimenten vergleichbar.
• Korrelation RNA vs. Protein: Auf globaler Ebene zeigten sich hohe visuelle Korrelationen zwischen Transkripten und Proteinen (z. B. CD3E, CD20, Ki67). Auf Einzelzell-Ebene waren jedoch signifikante Unterschiede feststellbar:
  • Die Korrelation variierte stark je nach Marker (z. B. CD20/MS4A1: r=0,48 vs. CD3E/CD3E: r=0,15).
  • Viele Zellen zeigten Protein-Expression ohne detektierte Transkripte und umgekehrt.
• Biologische Relevanz der Integration:
  • T-Zellen, die beide Plattformen (RNA und Protein) als positiv identifizierten, zeigten die konsistentesten und biologisch sinnvollsten Muster.
  • Im Vergleich zu T-Zellen, die nur von einer Plattform erkannt wurden, zeigten die "beide-Plattformen"-Zellen in Tumorregionen eine signifikant erhöhte Expression von Aktivierungs-, Proliferations- und Effektor-Markern (z. B. Ki67, PD-1, Granzyme B, LAG3) auf beiden Ebenen (RNA und Protein).
  • Zellen, die nur von Xenium erkannt wurden, zeigten oft nur RNA-Signale, während IMC-only-Zellen oft nur Protein-Signale aufwiesen, was zu unvollständigen biologischen Schlussfolgerungen führen würde.

5. Bedeutung und Ausblick
Diese Studie liefert einen entscheidenden methodischen Fortschritt für die räumliche Multi-Omics-Forschung.

• Überwindung von Limitationen: Der Workflow umgeht die Beschränkungen kommerzieller "All-in-One"-Lösungen, indem er die Flexibilität von IMC (maßgeschneiderte Proteinpanels) mit der hohen Plexigkeit von Xenium kombiniert.
• Genauere Phänotypisierung: Die Ergebnisse unterstreichen, dass die alleinige Abhängigkeit von RNA oder Protein zu ungenauen Zellidentifikationen führen kann. Die Kombination beider Datenquellen liefert ein vollständigeres Bild der zellulären Funktion, des Zustands und der Interaktionen im Gewebe.
• Anwendungspotenzial: Diese Methode eignet sich besonders für die Validierung von Biomarkern, das Verständnis komplexer Krankheitsprozesse (wie Krebs-Immun-Interaktionen) und die Entwicklung präziserer therapeutischer Zielstrukturen.
• Herausforderungen: Die Autoren weisen auf technische Hürden hin, wie die Notwendigkeit manueller Registrierung (die zukünftig durch computergestützte Algorithmen verbessert werden sollte), potenzielle RNA-Degradation in alten FFPE-Proben und die Komplexität der Zellsegmentierung.

Zusammenfassend etabliert diese Arbeit einen robusten Standard für die gleichzeitige räumliche Profilierung von Transkriptomen und Proteomen auf einem einzigen Schnitt, was ein tieferes Verständnis der zellulären Landschaften in Geweben ermöglicht.