Combining xenium in situ spatial transcriptomics and imaging mass cytometry on a single tissue section

이 논문은 단일 조직 절편에서 Xenium 을 이용한 공간 전사체 분석과 이미징 질량 세포계수법 (IMC) 을 결합한 새로운 워크플로우의 타당성을 입증하고, RNA 와 단백질을 동시에 식별함으로써 세포 환경과 기능적 상호작용에 대한 보다 포괄적인 이해를 가능하게 함을 보여줍니다.

핵심

🏥 1. 연구의 배경: 왜 두 가지를 동시에 봐야 할까요?

과거에는 병리학자들이 조직을 볼 때 두 가지 방법 중 하나만 선택했습니다.

• 방법 A (Xenium): 세포가 **"무슨 말을 하고 있는지 (유전자/RNA)"**를 아주 많이 (최대 5,000 개) 들을 수 있습니다. 하지만 실제로 그 말이 행동으로 옮겨졌는지는 모릅니다.
  • 비유: 사람이 "나는 배가 고파"라고 말하고 있는 것을 듣는 것.
• 방법 B (IMC): 세포가 **"무슨 행동을 하고 있는지 (단백질)"**를 정확히 볼 수 있습니다. 하지만 한 번에 볼 수 있는 행동의 종류는 제한적입니다 (약 40 개).
  • 비유: 사람이 실제로 "밥을 먹고 있는 모습"을 보는 것.

문제점:
사람은 "배가 고프다"라고 말하면서도 실제로는 밥을 안 먹을 수도 있죠 (유전자와 단백질 불일치). 기존에는 이 두 가지를 다른 조직 조각에서 따로 찍어서 비교해야 했습니다. 하지만 조직 조각마다 세포 배치가 조금씩 다르기 때문에, "이 세포가 저 세포 옆에 있었나?"를 정확히 알기 어렵습니다.

이 연구의 목표:
**"한 장의 조직 슬라이드"**에서 먼저 유전자를 찍고, 그 위에 바로 단백질을 찍어서 완벽하게 같은 위치에서 두 정보를 모두 얻는 방법을 개발한 것입니다.

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🔬 2. 어떻게 했나요? (새로운 워크플로우)

연구진은 멜라노마 (피부암) 조직을 가지고 다음과 같은 실험을 했습니다.

1. 첫 번째 촬영 (Xenium): 먼저 유전자 (RNA) 를 찍었습니다. 마치 조직 전체를 스캔해서 "누가 무슨 말을 하고 있는지"를 기록하는 것입니다.
2. 검증: 유전자 촬영 후에도 조직이 망가지지 않았는지 확인했습니다. (H&E 염색으로 조직 상태를 확인)
3. 두 번째 촬영 (IMC): 유전자 촬영이 끝난 같은 조직 위에 바로 금속으로 표지된 항체를 붙여 단백질 (행동) 을 찍었습니다.
   • 핵심: "유전자 촬영을 하고 나면 조직이 녹아내리거나 망가져서 단백질 촬영이 안 되지 않을까?"라는 걱정이 있었지만, **결과는 "괜찮다!"**였습니다. 조직은 튼튼했고, 단백질 신호도 선명하게 나왔습니다.

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🧩 3. 어떤 발견이 있었나요? (유전자 vs 단백질)

두 기술을 하나로 합쳐 보니 흥미로운 사실이 드러났습니다.

• 전체적으로 비슷하지만, 개개인은 다릅니다:

  • 큰 그림으로 보면 유전자와 단백질이 일치하는 경우가 많았습니다. (예: "CD20"이라는 유전자가 있으면 단백질도 잘 나옴)
  • 하지만 개별 세포 하나하나로 보면 차이가 큽니다. 어떤 세포는 유전자를 많이 가지고 있지만 단백질은 적고, 또 어떤 세포는 그 반대일 수 있습니다.
  • 비유: "나는 운동할 거야"라고 말한 사람 (유전자) 이 실제로는 소파에 앉아 있을 수도 (단백질 부재) 있다는 뜻입니다.

• 가장 정확한 답은 "두 가지 모두"로 확인하는 것:

  • 유전자만 보고 세포를 구분하거나, 단백질만 보고 구분하는 것보다, 두 가지 정보를 모두 가진 세포를 찾아내는 것이 가장 정확했습니다.
  • 특히 암 조직 안과 밖의 T 세포 (면역 세포) 를 비교했을 때, 두 정보를 모두 가진 세포만이 진짜로 "암을 공격할 준비가 된 상태"인지 정확히 알려주었습니다.

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💡 4. 이 연구의 의미 (왜 중요할까요?)

이 연구는 **"하나의 조직에서 두 가지 세계 (유전자와 단백질) 를 동시에 보는 창"**을 열었습니다.

• 정확한 진단: 세포가 실제로 무엇을 하고 있는지, 단순히 말만 하는 것인지 구분할 수 있어 암 치료나 면역 반응 분석에 더 정확한 정보를 줍니다.
• 공간적 이해: "이 세포가 저 세포 바로 옆에 있어서 서로 영향을 주고받는구나"를 훨씬 정확하게 파악할 수 있습니다. (이전에는 다른 조직 조각을 비교해야 해서 위치가 어긋날 수 있었음)
• 미래의 가능성: 이제 의사와 연구자들은 세포의 '말'과 '행동'을 동시에 분석하여 더 정밀한 맞춤형 치료를 설계할 수 있게 되었습니다.

📝 한 줄 요약

"한 장의 조직 슬라이드에서 유전자 (말) 와 단백질 (행동) 을 동시에 찍어, 세포의 진짜 모습을 가장 정확하게 파악하는 새로운 방법을 개발했습니다."

이 방법은 마치 한 장의 사진으로 사람의 얼굴 (단백질) 과 그 사람의 생각 (유전자) 을 모두 읽는 것과 같아서, 복잡한 암 미세환경을 이해하는 데 큰 도움이 될 것입니다.

기술 요약

1. 문제 제기 (Problem)

• 단일 오믹스 (Single-omics) 의 한계: 기존 공간 오믹스 기술은 대부분 단백질 (프로테오믹스) 또는 RNA (전사체학) 중 하나만을 동시에 분석하는 데 제한되어 있습니다. 단백질은 세포의 기능적 상태를 더 잘 반영하지만, 동시 분석 가능한 타겟 수가 제한적 (약 40 개 미만) 입니다. 반면, Xenium 과 같은 공간 전사체학은 수천 개의 mRNA 를 동시에 측정할 수 있으나, 단백질 발현과의 불일치 가능성이 있습니다.
• 공간적 맥락의 손실: 기존에 단일 세포에서 RNA 와 단백질을 동시에 분석하는 방법 (예: CITE-seq) 은 조직의 공간적 맥락 (Spatial Context) 을 잃는 단점이 있습니다.
• 동일 조직 절편에서의 다중 오믹스 부재: 현재 CosMx 나 Xenium Protein 어세이와 같이 단일 플랫폼에서 mRNA 와 단백질을 동시에 측정하는 기술이 존재하지만, 사용자가 원하는 맞춤형 단백질 패널을 구성하기 어렵습니다. 또한, Xenium 과 IMC 를 **동일한 조직 절편 (Same-tissue section)**에서 순차적으로 수행하여 공간적 정렬을 완벽하게 맞추고 상호 검증하는 기술적 타당성에 대한 연구는 부족했습니다.

2. 방법론 (Methodology)

연구팀은 흑색종 (Melanoma) 림프절 전이 조직 마이크로어레이 (TMA) 를 사용하여 다음과 같은 신규 워크플로우를 구축했습니다.

• 샘플 준비 및 처리:

  • FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) 조직 절편 (5 µm) 을 Xenium 슬라이드에 장착했습니다.
  • 1 단계 (Xenium 분석): 10x Genomics 프로토콜에 따라 탈락, 탈가교, 프로브 하이브리드화, 증폭, 그리고 Xenium Analyzer 를 통한 377 개 유전자 타겟의 공간 전사체 분석을 수행했습니다.
  • 2 단계 (IMC 분석): Xenium 분석이 완료된 **동일한 슬라이드 (Slide A)**를 사용하여 IMC 를 수행했습니다. 40 개의 금속 표지 항체 패널 (T 세포, B 세포, 종양 세포 마커 등 포함) 을 사용하여 항원 회수 (Antigen Retrieval) 및 염색을 진행한 후, Hyperion Imaging System 으로 이미징을 획득했습니다.
  • 대조군: 인접한 조직 절편 (Slide B) 에는 Xenium 후 H&E 염색을 수행하여 조직 무결성을 확인했고, 별도의 슬라이드에는 IMC 만을 수행하여 (IMC Only) Xenium 전처리 과정이 단백질 신호에 미치는 영향을 비교했습니다.

• 데이터 통합 및 분석:

  • 이미지 정렬 (Registration): Visiopharm 소프트웨어를 사용하여 Xenium 의 DAPI 이미지와 IMC 의 DNA-Ir (이리듐 인터칼레이터) 이미지를 수동으로 정렬 (320 개의 핀 포인트 사용) 했습니다.
  • 세포 분할 (Segmentation): Xenium Analyzer 에서 생성된 세포 분할 마스크를 IMC 데이터에 적용하여 동일한 세포에 대한 전사체 및 단백질 데이터를 매핑했습니다.
  • 세포 유형 주석 (Annotation): 두 가지 접근법을 사용했습니다.
    1. 단일 마커 기반 (CD3E/MS4A1 등).
    2. 반감독 학습 클러스터링 (Semi-supervised clustering) 을 통한 다중 마커 기반 주석.
  • 일치도 분석: RNA 와 단백질이 모두 검출된 세포, 한쪽만 검출된 세포를 구분하여 생물학적 의미를 분석했습니다.

3. 주요 기여 (Key Contributions)

• 동일 절편 기반 다중 오믹스 워크플로우 확립: Xenium (전사체) 수행 후 동일한 FFPE 절편에서 IMC (단백질) 를 수행할 수 있음을 기술적으로 입증했습니다. 이는 인접 절편 분석 시 발생할 수 있는 공간적 불일치 문제를 해결합니다.
• 기술적 타당성 검증: Xenium 프로토콜 (고온 처리, 화학적 처리 등) 이 조직의 무결성과 후속 IMC 단백질 염색의 품질에 부정적인 영향을 미치지 않음을 확인했습니다.
• 통합 분석의 생물학적 가치 제시: 단일 플랫폼 (RNA 만 또는 단백질 만) 으로 식별된 세포군과 두 플랫폼을 모두 사용하여 식별된 세포군을 비교함으로써, 통합 분석이 세포의 기능적 상태와 공간적 상호작용을 더 정확하게 파악할 수 있음을 보였습니다.

4. 주요 결과 (Results)

• 조직 무결성 및 신호 품질:
  • Xenium 처리 후 H&E 염색과 IMC DNA-Ir 이미지는 조직 손실이 거의 없음을 보여주었습니다.
  • Xenium 후 IMC 수행 (Post-Xenium IMC) 과 별도의 IMC 실험 (IMC Only) 을 비교한 결과, SOX10 (종양 마커) 및 CD45 (면역 세포 마커) 와 같은 단백질 신호의 품질과 세포 정량화 결과에 유의미한 차이가 없었습니다.
• 전사체와 단백질 발현의 불일치 (Discordance):
  • 전체적인 공간 분포에서는 RNA 와 단백질 발현이 높은 상관관계를 보였으나, 단일 세포 수준에서는 상당한 불일치가 관찰되었습니다 (예: CD3E/CD3E 상관관계 r=0.15, CD20/MS4A1 상관관계 r=0.48).
  • 이는 전사체 발현이 항상 단백질 발현과 일치하지 않는 생물학적 현상 (전사 후 변형, 단백질 반감기 등) 과 각 플랫폼의 기술적 한계 (분할 오류, RNA 확산 등) 에 기인한 것으로 판단됩니다.
• 통합 분석의 우위성:
  • T 세포 분석: RNA 와 단백질 마커 모두로 T 세포로 식별된 세포군은, 단일 플랫폼으로만 식별된 세포군에 비해 종양 내부와 외부에서의 기능적 차이 (활성화, 증식, 효과기 기능 마커 발현) 를 가장 명확하고 생물학적으로 타당한 수준으로 보여주었습니다.
  • 종양 내 T 세포는 증식 (Ki67/MKI67) 및 효과기 기능 (Granzyme B/GZMB) 마커가 높게 발현되는 등, 통합 분석을 통해 더 깊은 기능적 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

5. 의의 및 결론 (Significance)

• 정확한 세포 특성 규명: 단일 오믹스 데이터만으로는 세포의 실제 상태를 오해할 수 있으며, RNA 와 단백질을 동시에 공간적으로 매핑함으로써 세포의 정체성과 기능을 더 정확하게 정의할 수 있습니다.
• 맞춤형 패널의 유연성: Xenium 과 IMC 를 결합함으로써, 10x Genomics 의 제한된 단백질 패널 대신 연구자가 필요로 하는 맞춤형 40 개 이상의 단백질 패널을 자유롭게 설계하여 사용할 수 있는 장점이 있습니다.
• 미래 연구 방향: 본 연구는 공간 생물학 분야에서 단일 세포 수준의 다중 오믹스 통합 분석의 가능성을 열었으며, 향후 더 정교한 이미지 정렬 알고리즘과 세포 분할 기술의 발전과 결합될 경우, 복잡한 질병 과정 (예: 암 미세환경) 을 이해하는 데 필수적인 도구가 될 것으로 기대됩니다.

결론적으로, 이 논문은 Xenium 과 IMC 를 단일 조직 절편에 적용하는 새로운 워크플로우의 기술적 실현 가능성을 입증했을 뿐만 아니라, 두 모달리티를 통합함으로써 얻어지는 생물학적 통찰력의 질적 향상을 실증적으로 보여주었습니다.