An autonomous system for multi-objective continuous evolution at scale

이 논문은 200 개의 독립적 터비도스탯과 96 개의 병렬 PACE 라군을 통합한 오픈소스 로봇 플랫폼 'TurboPRANCE'를 소개하여, 대규모 다목적 연속 진화를 자동화하고 고해상도 진화 궤적을 추적함으로써 복잡한 적합도 지형을 매핑하는 새로운 체계를 제시합니다.

핵심

1. 왜 이 시스템이 필요한가요? (기존의 문제점)

비유: "한 가지 맛만 찾는 요리사"
지금까지 과학자들이 원하는 단백질을 만들 때, 마치 한 가지 맛 (예: 단맛) 만 극대화하는 요리사처럼 행동했습니다. "이 재료가 더 달다면 좋겠지?"라고 생각하며 한 가지 조건만 계속 바꾸고 테스트했습니다.

하지만 자연界的 진화는 다릅니다. 자연은 한 번에 여러 가지 조건을 고려합니다. "단맛도 있어야 하지만, 짠맛도 적당해야 하고, 식감이 부드러워야 하며, 상하지도 않아야 해"처럼 수많은 조건을 동시에 만족시켜야 살아남습니다.

기존 실험실 방법들은 이 복잡한 '다중 조건'을 무시하고 한 가지 조건만 쫓다 보니, 진짜로 훌륭한 분자를 놓치거나, 한 가지 능력은 좋지만 다른 능력은 나빠지는 (트레이드오프) 결과를 얻기 쉬웠습니다.

2. TurboPRANCE 는 무엇인가요? (해결책)

비유: "200 개의 주방과 96 개의 요리 경연대회"
TurboPRANCE 는 **약 200 개의 독립된 주방 (세균 배양기)**과 **96 개의 요리 경연 대회장 (진화 실험실)**을 동시에 운영하는 거대한 로봇 시스템입니다.

• 자동화된 주방 (터비도스탯): 로봇이 200 개의 주방을 동시에 관리합니다. 각 주방의 요리사 (세균) 가 너무 많이 자라거나 너무 적어지지 않도록, 로봇이 자동으로 물을 넣고 빼며 정확한 양을 유지합니다.
• 연속적인 경연 (PACE): 이 주방에서 자란 요리사들이 96 개의 경연 대회장으로 이동합니다. 여기서 바이러스 (파지) 가 "이 요리사가 더 맛있는 음식을 만들면 더 많이 번식해!"라고 선택합니다.
• 로봇의 역할: 이 모든 과정을 사람이 개입하지 않고, 24 시간 내내 로봇이 자동으로 수행합니다.

3. 이 시스템의 놀라운 점 (핵심 기능)

① "한 번에 여러 가지 시나리오 실행" (다중 목표 진화)

기존에는 한 번에 하나의 실험만 할 수 있었지만, TurboPRANCE 는 동시에 여러 가지 실험을 할 수 있습니다.

• 비유: "A 라는 재료로 단맛을 극대화하는 실험"과 "B 라는 재료로 짠맛을 극대화하는 실험", 그리고 "A 와 B 를 섞어서 두 맛을 모두 잡는 실험"을 동시에 96 개 진행할 수 있습니다.
• 효과: 과학자들은 단백질이 여러 조건 (내구성, 효율성, 안전성 등) 을 동시에 만족하는 최적의 형태를 훨씬 빠르게 찾을 수 있습니다.

② "시간을 자유자재로 조절" (유연한 스케줄링)

이 로봇은 각 실험을 따로따로 시작하고 끝낼 수 있습니다.

• 비유: 어떤 실험은 아침에 시작하고, 어떤 것은 밤에 시작해도 됩니다. 한 실험이 끝나면 바로 다음 실험을 그 자리에 투입할 수 있습니다. 마치 클라우드 컴퓨팅처럼, 로봇의 능력을 여러 실험이 나누어 쓰게 됩니다.
• 장점: 실험이 실패하거나 변형이 필요해도, 전체 시스템을 멈추지 않고 필요한 부분만 교체하며 수주 동안 계속 운영할 수 있습니다.

③ "진화의 흔적을 실시간으로 추적" (고성능 분석)

이 시스템은 진화 과정을 실시간으로 지켜보며, 어떤 유전자 변이가 일어났는지도 아주 정밀하게 분석합니다.

• 비유: 마치 고해상도 CCTV로 진화 과정을 찍어두고, AI 가 그 영상을 분석해 "어떤 요리사가 언제, 어떤 재료를 추가했더니 맛이 좋아졌는지"를 한 글자 한 글자까지 찾아냅니다.
• 기술: 나노포어 (Nanopore) 라는 최신 시퀀싱 기술과 AI 를 결합하여, 수만 개의 변이를 동시에 정확하게 읽어냅니다.

4. 결론: 왜 이것이 중요한가요?

이 시스템은 단순히 "더 많은 실험"을 하는 것이 아니라, 진화의 지도를 더 정밀하게 그리는 것입니다.

• 과거: "이게 가장 좋은 거야!"라고 한 가지 정답만 찾았습니다.
• 현재 (TurboPRANCE): "이 조건에서는 A 가 좋고, 저 조건에서는 B 가 좋으며, 둘을 섞으면 C 가 최고야"라는 복잡한 관계와 균형을 찾아냅니다.

이 기술은 새로운 항생제, 더 효율적인 연료, 암을 치료하는 새로운 약물 등을 개발하는 데 혁명을 일으킬 것입니다. 마치 자연이 수억 년 동안 해온 '다중 목표 진화' 실험을 로봇이 몇 주 만에, 그리고 훨씬 더 똑똑하게 재현하는 것과 같습니다.

한 줄 요약:

"로봇이 200 개의 주방을 동시에 관리하며, 단백질이 여러 가지 조건을 동시에 만족하도록 '가상 진화'를 시키는 초고속 실험실입니다."

기술 요약

1. 문제 제기 (Problem)

• 자연 진화의 복잡성 vs. 실험적 한계: 자연界的 진화는 고차원적이며, 생물은 다양한 환경과 유전적 배경에서 동시에 여러 압력 (pressure) 에 적응합니다. 그러나 기존의 표적 진화 (Directed Evolution) 방법은 대부분 이러한 다차원적 특성을 단일 선택 축으로 축소하여, 트레이드오프 (trade-offs) 를 숨기고 학습 가능한 정보를 제한합니다.
• PACE 의 확장성 문제: 박테리오파지 보조 연속 진화 (Phage-Assisted Continuous Evolution, PACE) 는 다변수 선택에 적합하지만, 실제 대규모 적용에는 기술적 장벽이 존재했습니다.
  • 각 선택 조건마다 별도의 숙주 배양이 필요하며, 이를 일정한 감염 가능 농도 (OD600 0.4~0.6) 로 유지하기 위해 정밀한 연속 흐름 터비도스탯 (turbidostat) 이 필요합니다.
  • 기존 자동화 시스템 (예: PRANCE) 은 오프-데크 (off-deck) 배양에 의존하거나, 고정된 시간 간격으로 작동하여 다양한 성장 속도를 가진 균주들을 동시에 관리하기 어렵고, 오염 및 생물막 (biofilm) 축적으로 인한 운영 불안정성이 있었습니다.
• 데이터의 한계: 기존 방법으로는 고해상도의 시간 분해 진화 궤적 (time-resolved trajectories) 을 대규모로 생성하거나, 복잡한 적합도 지형 (fitness landscape) 을 매핑하기 어려웠습니다.

2. 방법론 (Methodology)

TurboPRANCE 는 Hamilton STARlet 액체 핸들링 로봇을 기반으로 한 통합 자동화 시스템으로, 다음과 같은 핵심 기술을 포함합니다.

• 대규모 독립 터비도스탯 및 라군 (Lagoon) 시스템:
  • 약 200 개의 독립적으로 제어되는 터비도스탯과 96 개의 병렬 PACE 라군을 통합했습니다.
  • 각 터비도스탯은 별도의 주기로 균형을 맞추고 시작할 수 있어, 비동기적 시작과 무인 운영이 가능합니다.
• 적응형 사이클 시간 제어 (Adaptive Cycle-Time Projection):
  • 고정된 시간 간격이 아닌, 로봇의 실제 작업 부하 (피펫팅 시간, 배지 보충, 샘플링 등) 를 실시간으로 예측하여 다음 희석 시점을 계산합니다.
  • 균주의 성장 속도 차이와 운영 변수 변화에 따라 **Δt(희석 간격)**를 동적으로 조정하여, 모든 배양액이 감염 가능한 농도 범위를 벗어나지 않도록 유지합니다.
• 오염 방지 및 무인 운영 설계:
  • 배치 처리 (Column Batching): 느리게 자라는 균주를 위해 여러 웰을 묶어 처리하여 라군으로 공급되는 총 부피를 확보합니다.
  • 오염 차단: 표백제 (bleach) 잔여물과 파지 (phage) 의 교차 오염을 막기 위해 더러운 팁 (dirty tips) 과 깨끗한 팁을 물리적으로 분리하고, 라군 샘플링 경로와 터비도스탯 팁 위치를 재배치했습니다.
  • 생물막 관리: 자동화된 플레이트 전환 (plate switching) 을 통해 장기간 운영 중 발생하는 생물막 축적을 해결합니다.
• 고처리량 시퀀싱 파이프라인:
  • Nanopore 롱리드 시퀀싱과 DeepVariant(딥러닝 기반 변이 호출기) 를 결합하여, 진화하는 집단 내의 단일 분자 수준 해플로타입 (haplotype) 을 추적하고 기술적 오류를 필터링합니다.

3. 주요 기여 (Key Contributions)

• TurboPRANCE 플랫폼 개발: 오픈소스 로봇 플랫폼으로서, 200 개 이상의 독립적인 배양 환경을 동시에 관리하고 96 개의 병렬 진화 실험을 수행할 수 있는 최초의 시스템입니다.
• 다목적 선택 압력의 조합 (Combinatorial Selection): 서로 다른 균주 배경, 회로, 유도제 상태, 배지 조성을 가진 터비도스탯들을 라군에 임의의 비율로 혼합하거나 시간에 따라 재배치하여, 무한에 가까운 선택 압력의 조합을 구현합니다.
• 적응형 제어 알고리즘: 로봇의 물리적 한계와 생물학적 성장 동역학을 실시간으로 고려하여, 고정된 타이밍이 아닌 예측 기반의 적응형 제어를 통해 안정적인 장기 운영을 가능하게 했습니다.
• 고해상도 진화 추적: 롱리드 시퀀싱과 딥러닝 변이 호출을 결합하여, 집단 수준의 변이 동역학과 해플로타입의 출현/소멸을 고해상도로 매핑하는 파이프라인을 정립했습니다.

4. 주요 결과 (Results)

• 시스템 안정성 및 확장성:
  • 96 개의 Keio Knockout 균주 컬렉션을 대상으로 성장 속도 테스트를 수행했으며, 터비도스탯 OD 설정점 (0.21.2) 과 라군 유량 (0.21.0 vol/hr) 을 체계적으로 변형하여 최적 조건을 규명했습니다.
  • 최대 6 일 동안 유지된 터비도스탯에서도 성공적인 진화가 관찰되었으며, 이는 장기간 운영 중 균주가 불안정해지더라도 라군 실험을 중단하지 않고 새로운 균주로 교체 (staggered initiation) 할 수 있음을 입증했습니다.
• 다변수 파라미터 최적화:
  • T7 RNA 중합효소 (T7RNAP) 진화 실험을 통해, 중간 OD 설정점 (0.6) 과 중간 유량 (0.4~0.6 vol/hr) 이 진화 속도를 가장 빠르게 한다는 것을 확인했습니다.
  • 다양한 MOI (감염 비율) 조건에서도 진화가 성공적으로 이루어졌으며, 낮은 MOI 에서는 진화 속도가 지연되는 경향을 보였습니다.
• 다양한 회로 아키텍처 적용:
  • 비정형 아미노산 (ncAA) 통합 회로를 포함한 다양한 PACE 회로에서 TurboPRANCE 가 효과적으로 작동함을 입증했습니다.
  • 단일 라군 내에서 여러 선택 압력을 혼합하거나, 실험 도중 선택 강도를 동적으로 변경하는 것이 가능함을 시연했습니다.
• 시퀀싱을 통한 진화 궤적 매핑:
  • Nanopore 시퀀싱과 DeepVariant 를 통해 T7RNAP 의 주요 적응 변이 (M219R, N748D 등) 를 고빈도로 검출했을 뿐만 아니라, 이전에 보고되지 않은 저빈도 변이 (K98R, G753S 등) 도 발견했습니다.
  • 단일 리드 수준에서 해플로타입을 분해하여, 여러 변이가 어떻게 조합되어 나타나는지 (epistasis) 를 분석할 수 있었습니다.

5. 의의 및 중요성 (Significance)

• 단일 목적 최적화에서 다목적 탐색으로의 전환: TurboPRANCE 는 단백질 공학을 단일 특성 최적화에서 벗어나, 자연 진화와 유사한 다중 목적 (다중 기질, 안정성, 특이성 등) 을 동시에 탐색하는 체계적인 프레임워크를 제공합니다.
• 인공지능 (AI) 을 위한 고품질 데이터 생성: 기존 AI 기반 단백질 설계는 데이터의 희소성과 편향에 시달려 왔습니다. TurboPRANCE 는 다양한 선택 압력 하에서 생성된 고밀도, 다변수, 시간 분해 진화 데이터를 제공함으로써, 강화 학습 (Reinforcement Learning) 과 유사한 방식으로 AI 모델의 훈련 데이터를 풍부하게 할 수 있습니다.
• 표준화 및 접근성: 오픈소스 소프트웨어와 모듈형 하드웨어 설계를 통해, 다양한 실험실 환경에 쉽게 적용 가능하도록 하여 대규모 연속 진화 실험의 장벽을 낮췄습니다.
• 미래 지향적 플랫폼: 이 시스템은 단순히 분자를 진화시키는 도구를 넘어, 선택 압력이 서열 공간 (sequence space) 과 기능에 미치는 영향을 정량적으로 연구할 수 있는 '진화 실험실'로서의 역할을 수행합니다.

요약하자면, TurboPRANCE 는 로봇 자동화, 적응형 제어 알고리즘, 그리고 차세대 시퀀싱 기술을 융합하여, 이전에는 불가능했던 규모와 복잡도로 다목적 단백질 진화를 수행하고 그 과정을 고해상도로 추적할 수 있는 혁신적인 플랫폼입니다.