Genomic and environmental determinants of circular single-stranded DNA production in engineered E. coli

في عالم التكنولوجيا الحيوية الحديثة، تُعد خيوط الحمض النووي (DNA) أحادية الشريطة أدوات لا غنى عنها. فهذه السلاسل الطويلة والمرنة من الشفرة الوراثية تعمل كركائز لبناء هياكل مجهرية، ونماذج لتعديل الجينات، ومخططات لأدوية جديدة. ولعقود من الزمن، اعتمد العلماء على المصانع الكيميائية لربط هذه الخيوط معاً، لكن هذه الطريقة تصطدم بحائط مسدود عندما تصبح الخيوط طويلة جداً؛ إذ تصبح العملية بطيئة، ومكلفة، وعرضة للأخطاء. ومع ذلك، فإن الطبيعة قد حلت هذا المشوء بالفعل؛ حيث ينتج نوع معين من الفيروسات التي تصيب البكتيريا، يُعرف باسم "عاثية M13" (M13 bacteriophage)، خيوطاً دائرية طويلة من الحمض النووي أحادي الشريطة كجزء من دورة حياته. ولسنوات، حاول الباحثون تسخير هذه الآلية الفيروسية لإنتاج كميات ضخمة من خيوط الحمض النووي المخصصة، لكن الطرق التقليدية كانت فوضوية، إذ غالباً ما تتضمن رقصة معقدة من الفيروسات المساعدة والبلازميدات، مما يؤدي إلى منتج نهائي مليء بالبقايا الوراثية غير المرغوب فيها، مما يجعل من الصعب استخدامه في التطبيقات الطبية الدقيقة.

لقد سعى فريق من الباحثين في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو، لتنظيف هذه العملية وجعلها قابلة للتوسع. فقد قاموا سابقاً بهندسة سلالة من البكتيريا، أطلقوا عليها اسم "إي-سكاف" (eScaf)، تحمل تعليمات الحمض النووي الفيروسي مباشرة في شفرتها الوراثية الخاصة بدلاً من الاعتماد على مساعدين خارجيين. أنتج هذا النهج حمضاً نووياً نقياً للغاية، لكن الكمية التي تم حصادها كانت صغيرة جداً للاستخدام العملي، حيث لم تكن تعطي سوى جزء ضئيل مما هو مطلوب للعلاجات واسعة النطاق. وفي عملهم الأخير، اختبر الفريق بشكل منهجي كيفية حث هذه البكتيريا على إنتاج الكثير من الحمض النووي دون فقدان تلك النقاء الجوهري. ومن خلال تعديل الغذاء الذي تتناوله البكتيريا، وتغيير السلالة البكتيرية نفسها، وتعديل عدد نسخ التعليمات الفيروسية المخزنة في الخلية، حولوا فضولاً مختبرياً إلى نظام إنتاج قوي. واكتشفوا أن كمية الحمض النووي المنتجة تعتمد بشكل كبير على مكان وضع التعليمات الفيروسية في جينوم البكتيريا وعدد النسخ الموجودة. ومن خلال سلسلة من التجارب الدقيقة، رفعوا العائد من حوالي مائة ميكروغرام لكل لتر إلى حوالي أربعة ملليغرامات لكل لتر، وهو تحسن بمقدار أربعين ضعفاً يقرب هذه التكنولوجيا من النطاق المطلوب للتصنيع الطبي في العالم الحقيقي.

بدأت الرحلة بسؤال بسيط: ماذا تحتاج البكتيريا لتأكله لإنتاج أكبر قدر من الحمض النووي؟ قام الباحثون بزراعة بكتيرياهم المهندسة في أنواع مختلفة من الحساء الغني بالمغذيات، مقارنين بين المرق المختبري القياسي وخلطات أكثر تعقيداً. ووجدوا أن مرقاً غنياً وكثيف المغذيات يسمى "تيريفيك بروث" (Terrific Broth) ساعد بالفعل البكتيريا على إنتاج المزيد من الحمض النووي، لكن ذلك جاء مع عقبة؛ فقد كان المنتج النهائي ملوثاً بمواد وراثية إضافية غير مرغوب فيها، مما قلل من نقائه. أما الخليط الآخر، المعروف باسم "2xYT"، فقد سمح للبكتيريا بالنمو بشكل أكبر ولكنه لم يجعلها بالضرورة أكثر كفاءة في إنتاج الخيوط الفيروسية. أدرك الفريق أنهم بحاجة إلى حل مخصص يوازن بين النمو والإنتاج. فقاموا بصياغة وسط جديد، أطلقوا عليه اسم "وسط إي-سكاف" (eScaf medium)، عن طريق إزالة الملح وإضافة مكونات محددة مثل الجلسرين. فعل هذا الوصف الجديد شيئاً مذهلاً: لقد شجع البكتيريا على تركيز طاقتها على إنتاج خيوط الحمض النووي المطلوبة بدلاً من مجرد النمو كخلايا أكبر. وباستخدام مصدر الغذاء الأمثل هذا، رأى الفريق كمية الحمض النووي القابلة للاستخدام تقفز بشكل كبير، مما أثبت أن ما تستهلكه البكتيريا يحدد مباشرة جودة وكمية المنتج الوراثي الذي تطلقه.

بعد ترتيب مسألة الغذاء، وجه الباحثون اهتمامهم إلى البكتيريا نفسها. وتساءلوا عما إذا كانت الخلفية الوراثية المحددة للسلالة المضيفة تهم. فقاموا باختبار البكتيريا الأصلية مقابل سلالتين أخريين متاحتين تجارياً، إحداهما هندست لإنتاج بلازميد عالي الكفاءة. كانت النتائج مذهلة؛ حيث أنتجت إحدى السلالات الجديدة، المشتقة من سلالة تسمى "5α"، أكثر من ضعف كمية الحمض النووي التي أنتجتها البكتيريا الأصلية، بينما أنتجت سلالة أخرى كمية أقل. أشار هذا إلى أن الآلية الداخلية للخلية تلعب دوراً رئيسياً في كيفية تعبئة الحمض النووي الفيروسي وإطلاقه. كما جرب الفريق إضافة علامة جزيئية صغيرة، وهي سلسلة من الأحماض الأمينية، إلى أحد بروتينات الغلاف الفيروسي. كان الهدف من هذه العلامة هو المساعدة في التنقية، لكنها أدت إلى تأثير جانبي غير متوقع: فقد عززت بشكل كبير كمية الحمض النووي المنتجة. ويشتبه الباحثون في أن هذه العلامة قد تساعد جزيئات الفيروس على الخروج من الخلية بشكل أكثر كفاءة، مما يمنعها من العلوق أو إعادة الامتصاص، رغم أن الآلية الدقيقة لا تزال موضوعاً لمزيد من الدراسة.

تضمنت القطعة الأخيرة من اللغز عدد مجموعات التعليمات الفيروسية داخل البكتيريا. كانت السلالة الأصلية تحمل نسخة واحدة فقط من الجينوم الفيروسي، وهو تصميم اختير لمنع الفيروس من أن يصبح ساماً للمضيف. ومع ذلك، افترض الفريق أن وجود نسخ أكثر قد يزيد الإنتاج، بشراً ما تستطيع البكتيريا تحمل العبء الإضافي. نجحوا في هندسة سلالات تحتوي على نسختين وثلاث و even خمس نسخ من الجينوم الفيروسي المدمجة في مواقع مختلفة داخل الكروموسوم البكتيري. ووجدوا أن العائد لا يرتفع ببساطة مع كل نسخة مضافة؛ بل إن موقع الدمج كان لا يقل أهمية عن عدد النسخ. فقد أنتجت سلالة تحتوي على خمس نسخ مدمجة في مواقع محددة عالية الأداء، أكبر كمية من الحمض النووي على الإطلاق. وعندما جمعوا هذه السلالة عالية النسخ مع وسط الغذاء الأمثل الخاص بهم، كانت النتائج تحولية. ففي قارورة مختبرية قياسية، أنتجت السلالة الجديدة، التي أطلقوا عليها اسم "إي-سكاف-آي إس 3" (eScaf-IS3)، متوسط 4.6 ملليغرام من الحمض النووي لكل لتر من المزرعة.

هذا المستوى من الإنتاج يمثل عتبة حرجة. فبينما كانت الطرق السابقة توفر فقط ما يكفي من الحمض النووي للتجارب صغيرة النطاق، فإن النظام الجديد يولد كميات كافية للفحص عالي الإنتاجية للعلاجات المحتملة وتصنيع الهياكل المعقدة من الحمض النووي المستخدمة في الطب المتقدم. اختبر الباحثون نظامهم في مفاعلات حيوية كبيرة وخاضعة للرقابة، ووجدوا أن استراتيجيات التغذية المستخدمة في التخمير الصناعي يمكن أن تدعم النمو بشكل أكبر، مما يشير إلى إمكانية تحقيق عوائد أعلى. يوضح هذا العمل أنه من خلال ضبط البيئة والهيكل الوراثي للمضيف بعناقة، من الممكن تحويل بكتيريا بسيطة إلى مصنع عالي الكفاءة للحمض النووي المخصص. يزيل هذا التقدم عقبة رئيسية في هذا المجال، مما يجعل من الممكن إنتاج الخيوط الطويلة والنقية من الشفرة الوراثية اللازمة لعلاجات الجيل القادم، من الخلايا المناعية المهندسة إلى الآلات الجزيئية واسعة النطاق، دون التكلفة والتعقيد اللذين حدوا من استخدامها سابقاً.