Identification of atoxigenic Aspergillus flavus from stored grains in controlling aflatoxin contamination in maize
تحدد هذه الدراسة وتقيم عزلات من فطر *Aspergillus flavus* غير المنتجة للسموم من الذرة في بنغلاديش، وتُظهر أنه بينما تعمل معظمها على تقليل تلوث الأفلاتوكسين بشكل كبير في كل من البيئات المختبرية والبيئات النباتية، فإن الأمر يتطلب مزيداً من التوصيف الجيني لتأكيد ملاءمتها لتطوير منتجات المكافحة الحيوية نظراً لما لوحظ من عدم اتساق بين وجود الجينات وإنتاج السموم.
المؤلفون الأصليون:Md. Mostafa Masud, Ahmed Zonaid, Sanjana Hossain Nijhum, Muhtarima Jannat, Intisarul Azim, Umma Kulsum Keya, Vumika Roy, Protik Paul, Farhan Ul Islam, Anirban Dey Orko, Mohammad Ali Jinnah, Md. RashidMd. Mostafa Masud, Ahmed Zonaid, Sanjana Hossain Nijhum, Muhtarima Jannat, Intisarul Azim, Umma Kulsum Keya, Vumika Roy, Protik Paul, Farhan Ul Islam, Anirban Dey Orko, Mohammad Ali Jinnah, Md. Rashidul Islam
يواجه الذرة، تلك الحبوب الذهبية التي تغذي المليارات وتغذي الماشية، عدواً صامتاً وغير مرئي. فداخل حبات الذرة المخزنة يكمن نوع من المواد السامة يسمى "الأفلاتوكسين". هذه السموم لا يصنعها النبات نفسه، بل تفرزها فطريات مجهرية تُعرف باسم "الأسبرجيلوس فلافوس" (Aspergillus flavus). عندما يصيب هذا الفطر الحبوب، فإنه ينتج هذه المواد الكيميائية، وهي خطيرة لدرجة أن كميات ضئيلة جداً منها يمكن أن تسبب أمراضاً شديدة وسرطاناً للإنسان والحيوان. ولأن هذه السموم عديمة اللون والرائحة، فمن المستحيل اكتشافها دون معدات متخصصة، مما يجعل الذرة الملوثة خطراً خفياً في الإمدادات الغذائية في جميع أنحاء العالم. ولعقود من الزمن، بحث العلماء عن طريقة لمنع هذا الفطر من إنتاج سمومه، باحثين عن حل يكون آمناً وطبيعياً وفعالاً.
في دراسة حديثة، سعى باحثون في جامعة بنغلاديش الزراعية لإيجاد دفاع طبيعي ضد هذا التهديد. لقد وجهوا اهتمامهم إلى نوع محدد من الفطر الذي، رغم أنه يبدو ويتصرف مثل النوع الخطير، قد فقد القدرة على صنع السم. تُسمى هذه الأنواع "السلالات غير المنتجة للسموم" (atoxigenic strains). الفكرة بسيطة ولكنها قوية: إذا أدخلت هذه السلالات غير الضارة في حقل ذرة، يمكنها أن تطرد السلالات الخطيرة المنتجة للسم، مما يؤدي فعلياً إلى منع إنتاج السم قبل وصوله إلى الحبوب. جمع الفريق عينات من خمسة عشر منطقة مختلفة لزراعة الذرة في بنغلاديش، بحثاً عن هذه النسخ الأصلية وغير الضارة من الفطر. وقد قاموا بعزل أربع وأربعين سلالة متميزة وأخضعوها لسلسلة صارمة من الاختبارات لمعرفة ما إذا كان بإمكانها حقاً أن تعمل كدرع للمحصول.
كان على العلماء أولاً التأكد مما يتعاملون معه بالضبط. وباستخدام طريقة تقرأ الشفرة الوراثية للفطر، تحققوا من أن جميع العينات الـ 44 هي بالفعل من نوع "الأسبرجيلوس فلافوس". ثم بحثوا عن التعليمات الجينية المحددة التي تسمح للفطر ببناء الأفلاتوكسين. وجدوا أن ثلاثاً وثلاثين عينة تفتقر تماماً إلى هذه التعليمات، مما أكد أنها غير ضارة. ومع ذلك، كانت إحدى عشرة عينة لا تزال تحمل بعض هذه التعليمات الجينية، مما يشير إلى أنها قد تكون قادرة على صنع السموم. لم يكن هذا الفحص الجيني الأولي سوى البداية؛ فالاختبار الحقيقي كان مراقبة كيفية سلوك هذه السلالات عند مواجهتها للذرة فعلياً.
أجرى الباحثون نوعين من التجارب. أولاً، وضعوا السلالات الفطرية على حبات الذرة في بيئة مخبرية مضبوطة. وهنا، لاحظوا مزيجاً مفاجئاً من النتائج. فقد نجحت بعض السلالات التي تم التأكد جينياً من أنها غير ضارة في القيام بعمل رائع، حيث قللت كمية السم في الحبوب بنسبة تصل إلى اثنين وتسعين بالمائة. بينما كانت سلالات أخرى أقل فعالية. والأهم من ذلك، أن بعض السلالات التي تم التأكد جينياً من أنها غير ضارة تسببت في رفع مستويات السم قليما، بينما نجحت بعض السلالات التي لا تزال تحمل التعليمات الجينية لصنع السم بشكل مفاجئ في تقليل مستويات السم. أظهر هذا أن مجرد النظر إلى الجينات لا يكفي للتنبؤ بكيفية تصرف الفطر في سيناريو واقعي.
ثم نقل الفريق تحقيقاته إلى بيئة أكثر واقعية، حيث قاموا بزراعة الذرة في أصص وتلقيح كيزان الذرة النامية بالسلالات الفطرية. وفي هذه البيئة، كانت النتائج أكثر اتساقاً وتشجيعاً. فقد قللت كل سلالة تقريباً، بغض النظر عما إذا كانت مؤكدة جينياً بأنها غير ضارة أم لا، من كمية الأفلاتوكسين في الذرة. حيث قللت تسع عشرة سلالة مستويات السم بأكثر من تسعين بالمائة، وقللت عشرون سلالة أخرى مستوياتها بأكثر من ثمانين بالمائة. حتى السلالات التي قدمت أداءً ضعيفاً في المختبر، أو تلك التي كانت تمتلك جينياً القدرة على صنع السم، أثبتت كفاءة عالية في إيقاف السم عند العمل على النبات الحي. إحدى السلالات، على وجه الخصوص، والتي زادت مستويات السم في المختبر، قللتها بأكثر من تسعين بالمائة في الحقل.
تشير هذه النتائج إلى أن السلالات الأصلية للفطر الموجودة في بنغلاديش هي مرشحات قوية لتكون منتجاً للتحكم البيولوجي. وتبرز الدراسة أن البيئة تلعب دوراً حاسماً؛ فما يحدث في طبق بتري لا يتنبأ دائماً بما يحدث على نبات نامٍ. وخلص الباحثون إلى أنه بينما تعد الاختبارات الجينية نقطة انطلاق مفيدة، إلا أنها ليست الكلمة الأخيرة. وللتأكد من أن سلالة ما آمنة وفعالة للاستخدام على نطاق واسع، يلزم إجراء المزيد من التحليل لفهم كيفية تفاعل هذه الفطريات بدقة مع الحبوب ولماذا تتصرف بعضها بشكل مختلف في المختبر مقابل الحقل. ويؤكد هذا العمل أن الطبيعة قد وفرت بالفعل حلاً محتملاً، لكن إطلاق كامل إمكاناتها يتطلب فهماً أعمق للعلاقة المعقدة بين الفطر والنبات والتربة.
ملخص تقني: تحديد سلالات Aspergillus flavus غير المنتجة للسموم من الحبوب المخزنة للتحكم في تلوث الأفلاتوكسين في الذرة
بيان المشكلة تعد الذرة (Zea mays) محصولاً حبوبياً حيوياً في بنغلاديش، حيث تعمل كمصدر أساسي لأعلاف صناعتي الدواجن والأسماك. ومع ذلك، يتعرض إنتاج الذرة لضرر شديد بسبب التلوث بالأفلاتوكسينات، وهي نواتج أيض ثانوية مسرطنة تنتجها أنواع من فطر Aspergillus، لا سيما A. flavus و A. parasiticus. يُصنف الأفلاتوكسين B1 كعنصر من المجموعة الأولى في المسرطنات البشرية، ويرتبط التعرض له في بنغلاديش بارتفاع حالات سرطان الكبد والتلوث المستمر في الإمدادات الغذائية. وبينما توجد استراتيجيات مختلفة للحد من التلوث قبل وبعد الحصاد (مثل إزالة السموم كيميائياً، وتحسين النظافة، والمعالجات الفيزيائية)، إلا أن أي منها لا يوفر حماية كاملة بسبب تعقيد عوامل التلوث. وبناءً على ذلك، برز التحكم البيولوجي باستخدام سلالات محلية من A. flavus غير المنتجة للسموم (atoxigenic) كاستراتيجية واعدة؛ حيث تعمل هذه السلالات على منافسة السلالات المنتجة للسموم على المساحة البيئية (niche space)، مما يؤدي إلى تثبيط إنتاج الأفلاتوكسين. ورغم وجود هيئة سلامة الأغذية في بنغلاديش (BFSA)، لم يسبق لأي بحث في بنغلاديش تقييم عزلات A. flavus المحلية غير المنتجة للسموم كعوامل تحكم بيولوجي، كما لم تكن هناك حدود تنظيمية معتمدة للأفلاتوكسين في الذرة وقت إجراء الدراسة.
المنهجية استخدمت الدراسة نهجاً متعدد المراحل لعزل وتحديد وتقييم سلالات A. flavus من حبوب الذرة عبر خمس عشرة منطقة لزراعة الذرة في بنغلاديش:
العزل والتعريف المورفولوجي: تم طحن عينات الذرة وتعليقها في محلول Tween-80. وُزعت كميات من المعلق على وسط زراعي (Clean Up - CU agar) وحُضنت عند درجة حرارة 31 مئوية. جرى تنقية العزلات على وسط (Potato Dextrose Agar - PDA). وتم تحديد العزلات مورفولوجياً بناءً على لون المستعمرات الأخضر الزيتوني والسمات المجهرية (رؤوس كونيدية شعاعية، وحوامل كونيدية خشنة).
التعريف الجزيئي:
تأكيد النوع: تم تضخيم منطقة الفاصل النسبي الداخلي (ITS) باستخدام البادئات ITS1 وITS4. وأكد التسلسل أن العزلات هي من نوع A. flavus مع تشابه عالٍ مع السلالات المرجعية.
فحص القدرة على إنتاج السموم: أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن وجود جينات رئيسية في عنقود التخليق الحيوي للأفلاتوكسين: nor1 (نورسورولينيك أسيد ريدوكتاز)، و aflR (الجين التنظيمي)، و omtA (O-methyltransferase). صُنفت العزلات التي لم تظهر أي تضخيم لهذه الجينات الثلاثة بأنها غير منتجة للسموم (atoxigenic)، بينما صُنفت العزلات التي أظهرت تضخيماً لأي منها بأنها منتجة للسموم (toxigenic).
تقييم الفعالية:
في المختبر (In Vitro): تم تعقيم حبات الذرة، وتلقيحها بسلالات محددة من A. flavus (بتركيز 1×10⁶ كونيديا/مل)، وتحضينها عند 31 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
في النبات (In Planta): زُرعت نباتات الذرة في بيت شبكي. وفي مرحلة منتصف التزهير (mid-silking stage)، تم جرح كيزان الذرة اصطناعياً وحقنها بـ 10 ميكرولتر من المعلق الفطري.
تقدير كمية الأفلاتوكسين: تم حصاد الحبوب، وتجفيفها، وطحنها. استُخلص إجمالي تركيزات الأفلاتوكسين باستخدام ميثانول 70%، وتم تقدير الكمية باستخدام اختبار المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) مع مجموعة أدوات AgraQuant الخاصة بالأفلاتوكسين.
التحليل الإحصائي: حُللت البيانات باستخدام تحليل التباين (ANOVA) عبر برنامج MINITAB (الإصدار 19).
النتائج الرئيسية
العزل والفحص الجيني: تم الحصول على إجمالي 44 عزلة من A. flavus. كشف الفحص الجزيئي أن 33 عزلة تفتقر إلى تضخيم الجينات nor1 و aflR و omtA، مما صنفها كغير منتجة للسموم. بينما أظهرت إحدى عشرة عزلة تضخيماً إيجابياً لجين واحد على الأقل، مما صنفها كمنتجة للسموم.
الأداء في المختبر (In Vitro):
خفضت ثمان وثلاثون عزلة تراكم الأفلاتوكسين بشكل ملحوظ مقارنة بالمجموعة الضابطة، حيث تراوحت نسب الخفض بين 7% و92.35%. وكانت العزلات الأكثر فعالية هي AF71 (بنسبة خفض 92.35%)، و AF75 (92.03%)، و AF44 (91.40%).
أدت ست عزلات إلى زيادة تراكم الأفلاتوكسين (بنسب تتراوح بين 2.73% و49.16%). ومن الملاحظ أن العزلات AF72 و AF73 و AF76، التي تأكدت جينياً بأنها غير منتجة للسموم (لا يوجد تضخيم للجينات)، قد زادت مستويات الأفلاتوكسين في المختبر.
وعلى العكس من ذلك، فإن بعض العزلات المصنفة جينياً بأنها منتجة للسموم (مثل AF153، AF11، AF13، AF191، AF90) قد خفضت تراكم الأفلاتوكسين بشكل كبير (وصل إلى 91.19% للعزلة AF191).
الأداء في النبات (In Planta):
خفضت جميع العزلات باستثناء AF01 و AF165 تراكم الأفلاتوكسين في الذرة المزروعة ميدانياً مقارنة بالمجموعة غير الملقحة (p < 0.01).
حققت تسع عشرة عزلة خفضاً يزيد عن 90%، وحققت عشرون عزلة خفضاً يزيد عن 80%.
لوحظ وجود تباين ملحوظ مع العزلات AF72 و AF73: فبينما زادت من الأفلاتوكسين في المختبر، خفضته بنسبة تزيد عن 90% في النبات.
سجلت العزلات AF01 و AF165 أدنى معدلات خفض (67.10% و 74.65% على التوالي).
الأهمية والادعاءات تثبت الورقة أن عزلات A. flavus المحلية تمتلك إمكانات كبيرة كعوامل تحكم بيولوجي لتقليل تلوث الذرة بالأفلاتوكسين. وتسلط الدراسة الضوء على أن السلوك الظاهري (الحد من إنتاج السموم) لا يتوافق دائماً بشكل مثالي مع التصنيف الجيني (وجود أو غياب جينات التخليق الحيوي المحددة). وتحديداً، فإن بعض العزلات "المنتجة للسموم" قللت مستويات السم، بينما زادت بعض العزلات "غير المنتجة للسموم" من مستويات السم في المختبر، رغم أن معظمها كان أداؤه جيداً في النبات.
يخلص المؤلفون إلى أنه على الرغم من أن العزلات المحلية غير المنتجة للسموم واعدة، إلا أن طرق الفحص الجيني الحالية (PCR لـ nor1 و aflR و omtA) غير كافية للتنبؤ الكامل بفعالية التحكم البيولوجي أو لتأكيد الحذف الجزئي أو الكامل لعنقود جينات الأفلاتوكسين. وتدعي الورقة بتواضع أن هناك حاجة لمزيد من الأبحاث قبل إعلان هذه العزلات صالحة لتطوير منتجات التحكم البيولوجي التجارية. ويذكر المؤلفون تحديداً أن تحليل نمط تضخيم العنقود (CAP) وتنميط تسلسل السلسلة المفردة (SSR) ضروريان لتأكيد الحذف الجزئي أو الكامل لعنقود جينات التخليق الحيوي للأفلاتوكسين. وتؤكد الدراسة على ضرورة استخدام السلالات المتكيفة محلياً للتحكم البيولوجي نظراً لتفوق قدرتها على التكيف مع النظم البيئية الزراعية والمناخ وظروف التربة المحددة.