Scalable Hydrogel Nanoparticle Enrichment for Enhanced Mass Spectrometry-based Proteomic Analysis of Plasma or Volumetric Dried Blood Samples

إن جسم الإنسان عبارة عن مدينة صاخبة وواسعة من الجزيئات، وفي دورانه داخل الدم توجد مكتبة معقدة من البروتينات التي تروي قصة صحتنا. تعمل هذه البروتينات كرسل، حاملةً إشارات حول الشيخوخة، والمرض، واستجابة الجسم للإصابة. وبالنسبة للعلماء الذين يحاولون فهم حالات مثل مرض ألزهايمر، فإن قراءة هذه المكتبة أمر ضروري. ومع ذلك، فإن التنقل في هذه المكتبة صعب للغاية؛ ففي قطرة واحدة من الدم، تطغى بضعة آلاف من البروتينات عالية الوفرة، مثل تلك التي تحمل الأكسجين أو تحارب العدوى، على آلاف البروتينات النادرة والحاسمة التي قد تحمل مفتاح تشخيص المرض. وللعثور على هذه الإشارات النادرة، يجب على الباحثين أولاً تصفية "الضجيج"، وهي عملية كانت تتطلب تقليدياً كميات كبيرة من الدم يتم سحبها بواسطة متخصص ومعالجتها في المختبر. وهذا يخلق عائقاً أمام الدراسات طويلة الأمد حيث قد يحتاج المرضى إلى تقديم عينات بشكل متكرر أو من مواقع نائية. وتوفر طريقة أحدث، تستخدم أجهزة صغيرة لجمع حجم دقيق من الدم على بقعة جافة، وسيلة لتجاوز هذه العوائق، ولكن لا يزال من غير الواضح ما إذا كان يمكن تحليل البروتينات في هذه العينات الجافة بنفس العمق والدقة الموجودة في الدم السائل.

لقد شرع فريق من الباحثين في حل هذه المشكلة من خلال تطوير سير عمل مبسط يستغرق يوماً واحداً، وقادر على استخراج وتحليل البروتينات من كل من البلازما السائلة وهذه البقع الدموية الجافة. كان هدفهم هو إنشاء طريقة ليست عميقة بما يكفي للعثور على آلاف البروتينات فحسب، بل ودقيقة أيضاً بحيث يمكن الوثوق بالأرقام التي تولدها، وكل ذلك مع كونها بسيطة بما يكفي للتعامل مع عشرات العينات في آن واحد. لقد اختبروا تقنية محددة تتضمن جزيئات صغيرة متخصصة مصممة للإمساك بالبروتينات، مما يسحب البروتينات النادرة فعلياً من بين الحشود. ومن خلال تحسين هذه العملية، هدفوا إلى إثبات أن المعلومات المكتسبة من عينة دم جافة بسيطة ذاتية الجمع هي بنفس موثوقية عينة الدم التقليدية المسحوبة في المستشفى، مما يفتح الباب أمام دراسات واسعة النطاق كانت مستحيلة في السابق.

بدأ الباحثون باختبار نسختين مختلفتين من طريقة الاستخراج القائمة على الجسيمات هذه على بلازما الدم السائل. وقارنوا نهجهم بتقنيتين أخريين راسختين: إحداهما تستخدم آلة مؤتمتة بالكامل، والأخرى تعتمد على طريقة أبسط وغير معززة. أدت الآلة المؤتمت طريقة استثنائية، حيث حددت ما يقرب من 7,000 بروتين بدقة عالية، بينما عانت الطريقة البسيطة غير المعززة، حيث وجدت بروتينات أقل بكثير وأنتجت نتائج أقل اتساقاً. ومع ذلك، جاءت طريقة الباحثين القائمة على الجسيمات قريبة جداً من أداء الآلة المؤتمتة، حيث حددت أكثر من 6,000 بروتين بدرجة عالية من الدقة. أكد هذا النجاح الأولي أن نهجهم اليدوي المبني في المختبر يعد بديلاً قابلاً للتطبيق لتحليل الدم السائل.

إلا أن الاختبار الحقيقي تمثل في تطبيق هذه الطريقة على عينات الدم الجافة. فعندما انتقل الفريق إلى البقع الجافة، اكتشفوا أن نسختين من محلول الاستخلال (buffer) الخاص بهم يتصرفان بطريقتين متناقضتين؛ فالمحلول الذي حقق أفضل أداء في البلازما السائلة أدى أداءً ضعيفاً في العينات الجافة، بينما تفوق المحلول الآخر، الذي كان أقل فعالية في البلازما، في استخراج البروتينات من الدم الجاف. سلط هذا الاكتشاف الضوء على اختلاف جوهري بين نوعي العينات: في الدم السائل، تكون البروتينات ذائبة بالفعل وجاهزة للاحتجاز، بينما في الدم الجاف، تكون البروتينات محاصرة في مصفوفة صلبة ويجب استدراجها للخروج أولاً. ومن خلال استخدام المحلول الصحيح لكل نوع من أنواع العينات، تمكن الفريق من استعادة آلاف البروتينات من البقع الجافة، مما أثبت إمكانية تكييف الطريقة مع الأشكال المختلفة لجمع الدم.

ولجعل العملية سريعة بما يكفي للدراسات الكبيرة، عالج الباحثون أيضاً خطوة تكسير البروتينات إلى قطع أصغر للتحليل، وهي خطوة تستغرق وقتاً طويلاً. تقليدياً، تستغرق خطوة الهضم هذه ليلة كاملة، لكن الفريق اختبر ما إذا كان يمكن إنجازها في ساعتين فقط دون فقدان الجودة. ووجدوا أن الوقت الأقصر أنتج نتائج مطابقة تقريباً للعملية الأطول، دون أي فقدان ملحوظ في عدد البروتينات المحددة أو دقة القياسات. سمح هذا الاختراق بضغط سير العمل بأكمله في يوم واحد، محولاً إياه من عملية تستغرق عدة أيام إلى إجراء روتيني يمكن إتمامه على لوحة مختبر قياسية تحمل ستة وتسعين عينة في آن واحد.

عندما تحقق الفريق من صحة سير العمل الجديد هذا، الذي يستغرق يوماً واحداً ويعتمد على الأطباق، على مدار ثلاثة أيام منفصلة، كانت النتائج قوية. بالنسبة للبلازما السائلة، حددوا باستمرار ما يقرب من 5,000 بروتين فريد، مع قياسات كانت عالية التكرار من يوم لآخر. أما بالنسبة لعينات الدم الجافة، فقد حددوا أكثر من 3,600 بروتين، بمستوى من الاتساق، رغم أنه أقل قليلاً من البلازما، إلا أنه كان قوياً بما يكفي للتحليل العلمي الموثوق. والأهم من ذلك، أن البروتينات الموجودة في الدم الجاف طابقت تلك الموجودة في البلازما السائلة بدرجة عالية من التوافق. فقد ظهر حوالي ثلاثة أرباع البروتينات المشتركة في كلا نوعي العينات بوفرة مماثلة، مما يشير إلى أن عينات الدم الجافة تقدم انعكاساً حقيقياً ودقيقاً للمشهد البروتيني المتداول في الجسم.

ثم اختبر الباحثون ما إذا كان بإمكان هذه الطريقة اكتشاف بروتينات مرتبطة تحديداً بمرض ألزهايمر. بحثوا عن عشرين علامة معروفة مرتبطة بالحالة ووجدوا أن سبع عشرة منها كانت قابلة للكشف في نوع واحد على الأقل من أنواع العينات. ومن الأهمية بمكان أن البروتينات الرئيسية مثل "أبوليپوبروتين E" (apolipoprotein E)، وهو عامل خطر وراثي رئيسي لمرض ألزهايمر المتأخر، وُجدت في كل من العينات السائلة والجافة بدقة عالية. كما نجحت الطريقة أيضاً في تحديد بروتينات أخرى متعلقة بتجلط الدم والالتهابات كانت أكثر وفرة في الدم الجاف، ويرجع ذلك على الأرجح إلى وجود خلايا الدم الحمراء في عينة الدم الكامل. تشير هذه النتائج إلى أن سير العمل الجديد حساس بما يكفي لالتقاط الإشارات البيولوجية ذات الصلة، حتى من البيئة الصعبة للبقعة الدموية الجافة.

وعلى الرغم من أن الدراسة اقتصرت على عينات من شخصين فقط، إلا أن النتائج توفر أساساً قوياً للأبحاث المستقبلية. لقد أثبت الفريق أن سير العمل القابل للتوسع والذي يستغرق يوماً واحداً يمكنه بنجاح إثراء وتحليل البروتينات من كل من الدم السائل والجاف بدقة عالية. ومن خلال إثبات أن بقع الدم الجافة يمكن أن تعطي بيانات قابلة للمقارنة مع عينات البلازما التقليدية، فإن هذا العمل يزيل عقبة لوجستية كبيرة أمام الأبحاث السريرية. ويشير ذلك إلى أنه في المستقبل، يمكن للمرضى المحتمل مراقبة صحتهم أو المشاركة في دراسات أمراض واسعة النطح عبر مجرد جمع قطرة صغيرة من الدم في المنزل، وإرسالها عبر البريد، وتحليلها بنفس الصرامة التي تُحلل بها عينات المستشفيات. توفر هذه الطقة مساراً عملياً لفهم التواقيع البروتينية المعقدة للأمراض، مما يجعل التحليل البروتيني العميق متاحاً لمجموعة أوسع من الناس وفي مواقع أكثر تنوعاً.