Characterization of lactic and acetic acid bacteria and their phages from a California winery
تُوصّف هذه الدراسة بكتيريا حمض اللاكتيك وحمض الخليك المستمرة في أحد مصانع النبيذ في كاليفورنيا، وتستخلص عوافي (فاجات) جديدة قادرة على تثبيط هذه الكائنات المسببة للتلف، مما يشير إلى إمكانية استخدامها كعوامل تحكم ميكروبية مستهدفة أثناء إنتاج النبيذ.
النبيذ كائن حي، نظام بيئي سائل حيث تقوم الخميرة بتحويل عصير العنب إلى كحول. لكن هذا التحول توازن دقيق، يمكن أن يختل بسهولة بفعل غزاة غير مرئيين. مجموعتان من البكتيريا، تُعرفان باسم بكتيريا حمض اللاكتيك وبكتيريا حمض الخليك، هما المتهمتان المعتادتان عندما يفسد النبيذ. يمكن للمجموعة الأولى أن تحول النبيذ الأحمر المنعش إلى طعم حامض أو تمنحه لسعة تشبه الخل، بينما المجموعة الثانية هي المحرك الرئيسي وراء ذلك الطعم الحاد والحمضي للخل نفسه. لطالما اعتمد صُناع النبيذ على الإضافات الكيميائية لإبقاء هذه البكتيريا تحت السيطرة، لكن هذه الأساليب كانت أدوات فظة؛ إذ يمكنها قتل البكتيريا المفيدة اللازمة لملف النكهة النهائي للنبيذ، وغالبًا ما تترك خلفها بقايا كيميائية يفضل المستهلكون المعاصرون تجنبها. لطالما اشتبه العلماء في أن الطبيعة تقدم حلاً أكثر دقة: فيروسات تصطاد أنواعًا محددة فقط من البكتيريا. هذه الفيروسات، التي تسمى العاثيات (بكتيريوفاج)، تعمل مثل القناصين البيولوجيين، حيث تستهدف نوعًا واحدًا من البكتيريا بينما تترك بقية المجتمع الميكروبي دون مساس.
في دراسة حديثة، شرع الباحثون في معرفة ما إذا كان يمكن العثور على هؤلاء الصيادين الفيروسيين وتدريبهم لحماية النبيذ من الداخل إلى الخارج. ومن خلال العمل مع مصنع نبيذ في ليفيرمور بكاليفورنيا، جمع الفريق عينات في كل مرحلة رئيسية من مراحل صناعة النبيذ، بدءًا من الغسل الأولي للعنب وصولاً إلى التخمير النهائي. كانوا يبحثون عن الأنواع المحددة من البكتيريا التي تنجح في البقاء في البيئة القاسية والحامضية والكحولية لبرميل النبيذ. وباستخدام التسلسل الجيني، رسموا خريطة للمشهد البكتيري ووجدوا أنه بينما ماتت أنواع عديدة مع نضج النبيذ، استمرت سلالات عنيدة قليلة من بكتيريا حمض اللاكتيك وحمض الخليك من أول غسلة للعنب وصولاً إلى المنتج النهائي. وشملت هذه الناجيات أنواعًا محددة من البكتيريا المعروفة بالتسبب في الفساد، مما يؤكد أن التهديد حاضر طوال الرحلة بأكملها للنبيذ.
بعد تحديد الجناة البكتيريين المستمرين، وجه الباحثون اهتمامهم إلى البحث عن مفترساتهم الطبيعية. بحثوا في مياه الصرف الصحي والأطعرات المتخمرة، بحثًا عن فيروسات قد تهاجم هذه البواعث البكتيرية الخاصة بالنبيذ. وقد نجحوا في عزل عدة فيروسات جديدة، بما في ذلك فيروسان يصطادان بكتيريا شائعة مسببة للفساد، واثنان آخران يستهدفان بكتيريا حمض الخليك. وكان أحد هذه الاكتشافات مفاجئًا بشكل خاص: فيروس ضخم، كبير جدًا لدرجة أنه يُصنف كـ "عاثية ضخمة" (jumbo phage)، يصيب البكتيريا المكونة للخل. يحمل هذا الفيروس العملاق جينومًا أكبر بنحو أربع مرات من البكتيريا التي يصيبها، ويمتلك بنية جينية فريدة، بما في ذلك نسخ متعددة من الجينات التي تشبه المقصات الجزيئية، مما يشير إلى تاريخ تطوري معقد في مواجهة دفاعات مضيفه. كما حمل فيروس آخر وجد في الدراسة جينات تساعد في تعديل مادته الوراثية، وهي خدعة قد تساعده على التهرب من الأنظمة المناعية للبكتيريا.
اختبر الباحثون بعد ذلك ما إذا كان بإمكان هذه الفيروسات حقًا وقف نمو البكتيريا في ظروف تحاكي صناعة النبيذ الحقيقية. قاموا بخلط البكتيريا مع الفيروسات في عصير العنب والنبيذ، مما خلق بيئة ذات مستويات الحموضة والكحول نفسها الموجودة في مصنع النبيذ. كانت النتائج مشجعة. ففي عصير العنب، تمكنت الفيروسات من وقف نمو البكتيريا المسببة للفساد لمدة تصل إلى أسبوع، مما أبقى تعداد البكتيريا منخفضًا بينما ظل العصير ساكنًا. أما في النبيذ نفسه، فقد عانت البكتيريا من أجل النمو على الإطلاق بسبب المحتوى العالي من الكحول، ولكن في الأماكن التي تمكنت فيها من الظهور، حافظت الفيروسات على أعدادها أقل بكثير من العينات غير المعالجة. تشير الدراسة إلى أن هذه الفيروسات يمكن أن تكون أداة دقيقة لصُناع النبيذ، مما يسمح لهم بكبح البكتيريا غير المرغوب فيها دون إلحاق الضرر بالبكتيريا المفيدة أو تغيير كيمياء النبيذ بالمواد الكيميائية القاسية. وبينما لا تزال الأبحاث في مراحلها الأولى وتمثل إثباتًا للمفهوم وليس منتجًا تجاريًا نهائيًا، إلا أنها توضح أن الصيادين الفيروسيين من الطبيعة نفسها قد يكونون المفتاح للحفاظ على نظافة النبيذ وصفائه ونقائه ونكهته الأصلية.
ملخص تقني: توصيف بكتيريا حمض اللاكتيك وحمض الخليك والفاجات الخاصة بها من مصنع نبيذ في كاليفورنيا
بيان المشكلة يؤدي النمو غير المنضبط لبكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) وبكتيريا حمض الخليك (AAB) أثناء صناعة النبيذ إلى خسائر اقتصادية كبيرة من خلال تلف النبيذ، والذي يتميز بارتفاع الحموضة المتطايرة (VA)، وتوقف التخمر، والنكهات غير المرغوب فيها. تعتمد الممارسات الصناعية الحالية للتحكم الميكروبي بشكل كبير على الكبريتات والإنزيمات (مثل الليزوزيم). ومع ذلك، تفتقر هذه الطرق إلى النوعية، وغالبًا ما تثبط بكتيريا التخمر المالولاكتيكي (MLF) المفيدة مثل Oenococcus oeni، كما تعاني من قيود تتعلق بالحساسية لدرجة الحموضة (pH)، ونوافذ التطبيق الضيقة، وتصور المستهلكين. وبينما توفر العاثيات (الفاجات/phages) حلاً محتملاً نظراً لنطاق عائلها الضيق وقدرتها على التكاثر في البيئات المعقدة، إلا أن هناك فجوة كبيرة في الأدبيات العلمية فيما يتعلق بالفاجات التي تستهدف سلالات LAB وAAB المرتبطة بصناعة النبيذ. يركز معظم أبحاث LAB الموجودة حالياً على عزلات الألبان، وتكاد التقارير عن الفاجات المحللة (lytic phages) لبكتيريا AAB المرتبطة بالنبيذ تكون معدومة.
المنهجية استخدمت الدراسة مسحاً طولياً لعملية تخمر كابيرنيه سوفينيون (Cabernet Sauvignon) في مصنع نبيذ في ليفيرمور، كاليفورنيا، خلال حصاد عام 2025. تم جمع العينات في أربع مراحل متميزة: غسل العنب/الهرس، عصير العنب/المست (must)، نهاية التخمر الأولي، ونهاية التخمر المالولاكتيكي.
توصيف الميكروبيوم: تم إثراء العينات في أوساط اختيارية (MRS لـ LAB؛ وGYC المدعم بحمض الخليك والإيثانول والبنسلين لـ AAB) لالتقاط الأنواع ذات الوفرة المنخفضة. تم إجراء تسلسل تضخيم 16S (Oxford Nanopore) على مزارف الإثراء لتحديد الوفرة النسبية والأنواع البكتيرية المستمرة عبر مراحل التخمر المختلفة.
عزل وتوصيف الفاجات والجينومات: تم عزل الفاجات من مياه الصرف ومصادر الأغذية المخمرة (مثل الكيمتشي) باستخدام سلالات مضيفة من Levilactobacillus brevis وAcetobacter pasteurianus وAcetobacter fabarum المستمدة من عينات مصنع النبيذ. تم تسلسل جينومات الفاجات باستخدام Illumina MiSeq، وبالنسبة لفاج Acetobacter الكبير، تم استخدام Oxford Nanopore. تم تجميع الجينومات، وتوصيفها، ومقارنتها بقواعد بيانات NCBI باستخدام أدوات مثل VIRIDIC وBLAST وHHpred لتحديد التصنيف ونمط الحياة (المحلل مقابل المعتدل).
اختبار الفعالية: أجريت اختبارات تثبيط الفاج في ثلاثة ظروف: وسط MRS، وعصير العنب الأبيض المدعم بـ MRS، وعصير العنب الأبيض النقي (pH 4.2). تمت مراقبة النمو البكتيري عبر الكثافة الضوئية (OD) على فترات تتراوح من 90 ساعة إلى 7 أيام لتقييم أداء الفاج تحت ظروف صناعة النبيذ المحاكية.
المساهمات الرئيسية والنتائج
الاستمرار البكتيري: كشف تسلسل 16S أنه بينما هيمنت Lactococcus lactis في المراحل المبكرة، استمرت Lactiplantibacillus plantarum وLevilactobacillus lactis حتى نهاية التخمر المالولاكتيكي. ومن بين AAB، كانت Acetobacter oryzoeni وAcetobacter pasteurianus هي الأنواع السائدة والمستمرة طوال العملية. وسيطرت Oenococcus oeni على المرحلة النهائية بسبب التلقيح المتعمد من قبل صانعي النبيذ.
عزل وتوصيف فاجات جديدة:
فاجات LAB: تم عزل فاجين محللين جديدين، Indaco_L1 (135,623 زوج قاعدي) وIndaco_L2 (141,184 زوج قاعدي)، يستهدفان L. brevis. ينتميان إلى جنس Tybeckvirus (فصيلة Herelleviridae) ولكنهما يمثلان نوعين جديدين، حيث يتشاركان في تشابه DNA بنسبة 84.4% مع بعضهما البعض، وأقل من 95% من الهوية مع الأقارب المعروفين. بالإضافة إلى ذلك، تم استحثاث فاج معتدل، Brevisa (45,654 زوج قاعدي)، تلقائياً من جينوم المضيف L. brevis. يشفر Brevisa بروتينات شوك قاعدية من نوع Asp23-like، مما قد يساعد في مقاومة إجهاد المضيف.
فاجات AAB: تم عزل فاجين جديدين يستهدفان أنواع Acetobacter. يعد Vinphasol_A1 فاجاً "ضخماً" (3umbo phage) بطول (397,952 زوج قاعدي) يستهدف A. pasteurianus، ويمثل أول فاج ضخم مسجل لهذا الجنس. ويظهر بنية جينوم غير نمطية، وتكرارات جينية، ويشفر 14 نسخة من إنزيمات قطع الحمض النووي الموجه بالـ RNA (من نوع TnpB-like/CRISPR-Cas12 effectors). أما Vinphasol_A2 (56,636 زوج قاعدي)، فيستهدف A. fabarum ويشفر بشكل فريد إنزيمات لتخليق الكويوزين (queuosine)، وهي آلية قد تُستخدم للتهرب من أنظمة التقييد لدى المضيف. تشترك فاجات AAB في قلة التشابه التسلسلي مع مدخلات قاعدة بيانات NCBI الموجودة.
فعالية التثبيط: نجحت الفاجات المعزولة في تثبيط نمو مضيفاتها في ظروف التخمر المحاكية (MRS وعصير العنب/خليط MRS) لمدة تصل إلى 48 ساعة، حيث أظهر Vinphasol_A2 تثبيطاً شبه كامل لـ A. fabarum طوال فترة الاختبار التي استمرت 90 ساعة. في عصير العنب الأبيض النقي (pH 4.2) بدون تدعيم غذائي، أدى تطبيق واحد لـ Vinphasol_A1 وVinphasol_A2 عند نسبة عدوى عالية (MOI 1000) إلى كبح نمو Acetobacter لمدة تصل إلى 7 أيام، رغم ملاحظة إعادة نمو بكتيري بعد اليوم الرابع في بعض المكررات.
الأهمية والادعاءات يزعم المؤلفون أن هذه الدراسة تحدد أبكر المراحل التي يمكن فيها استهداف الميكروبات المسببة للتلف بشكل محدد، وتوفر أول توصيف للفاجات المحللة لأنواع Acetobacter المرتبطة بالنبيذ. وتسلط الأبحاث الضوء على أن الفاجات التي تستهدف عزلات تخمر النبيذ هي أقل دراسة مقارنة بعزلات الألبان.
تخلص الورقة إلى أن القدرة المثبتة لهذه الفاجات على تثبيط نمو L. brevis وAcetobacter لفترات ممتدة (تصل إلى 7 أيام) في بيئات حمضية تحتوي على الإيثانول، تشير إلى إمكانية تطبيقها كعوامل تحكم ميكروبي دقيقة. ويفترض المؤلفون أن الفاجات يمكن أن تعمل كبديل أو مكمل لمضادات الميكروبات القياسية، مما يوفر ميزة التخلص الانتقائي من سلالات التلف مع ترك بكتيريا MLF المفيدة (مثل O. oeni) سليمة. كما تشير الدراسة إلى أنه بينما تظهر تطبيقات الفاج المنفردة نتائج واعدة، فإن استخدام "كوكتيلات" الفاج قد يقلل بشكل أكبر من خطر تطور المقاومة في سيناريوهات صناعة النبيذ الواقعية.