Construction and Characterization of an mCherry-Labeled Lactiplantibacillus plantarum L3 Strain for Intestinal Distribution Studies

ملخص تقني: إنشاء وتوصيف سلالة Lactiplantibacillus plantarum L3 الموسومة ببروتين mCherry لدراسات التوزيع المعوي

بيان المشكلة
على الرغم من البحث الواسع في إمكانات البروبيوتيك لـ Lactiplantibacillus plantarum، إلا أن تمييز السلالات التي يتم إعطاؤها خارجياً عن البكتيريا الأصلية ذات الصلة الوثيقة داخل بيئة الجهاز الهضمي المعقدة يظل أمراً صعباً. وتواجه الطرق الحالية لتتبع توزيع البروبيوتيك، مثل التعداد القائم على المزارع، والتهجين المجهري الفلوري (FISH)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، قيوداً تتعلق بالنوعية، أو تعقيد معالجة العينات، أو الأهداف التجريبية. علاوة على ذلك، بينما توفر عملية التوسيم بالبروتين الفلوري استراتيجية بصرية لتتبع الكائنات الدقيقة، تركز العديد من الدراسات على فترات مراقبة قصيرة. وهناك حاجة لتوصيف استقرار التوسيم الفلوري عبر فترات زمنية ممتدة وفهم كيف تتطور أنماط التوزيع المعوي أثناء الإعطاء الفموي المتكرر مقابل الجرعات قصيرة الأمد.

المنهجية
استخدمت الدراسة نهجاً متعدد المراحل لإنشاء وتوصيف سلالة موسومة فلورياً:

1. بناء السلالة: تم تحويل بلازميد معاد التركيب (pSIP403-mCherry) يعبر عن بروتين mCherry محفز عن طريق الإدخال الكهربائي إلى L. plantarum L3. استخدم النظام محفز PsppA، الذي يتطلب إضافة ببتيد التحفيز SppIP لتنشيط تعبير mCherry.
2. التحقق والتوصيف:
   • التأكيد الجزيئي: أكد تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرات (Colony PCR) وتسلسل الحمض النووي دمج جين mCherry (حوالي 711 زوجاً من القواعد).
   • التعبير البروتيني: أكد تحليل "وسترن بلوت" (Western blotting) تعبير بروتين mCherry الذي يبلغ وزنه حوالي 27 كيلو دالتون.
   • المجهر: استُخدم المجهر البؤري الليزري لتصور الفلورة الحمراء وتقييم شكل الخلايا.
   • التقييم الفسيولوجي: قارنت منحنيات النمو (OD600) بين السلالة الموسومة والسلالة البرية. كما تم قياس النشاط المضاد للميكروبات ضد Staphylococcus aureus و Bacillus subtilis و Listeria monocytogenes و Escherichia coli عبر طريقة كوب أكسفورد. وقيمت عملية الهضم المعوي المحاكية (اللعاب، عصير المعدة، الصفراء، وسوائل الأمعاء الدقيقة) معدلات البقاء على قيد الحياة.
   • اختبار الاستقرار: تم تمرير السلالة عبر 98 جيلاً لتقييم الاستقرار الجيني للفلورة والاحتفاظ بالبلازميد عبر PCR.
3. دراسة التوزيع داخل الجسم الحي: تم إعطاء الفئران من نوع C57BL/6J سلالة mCherry الموسومة فموياً يومياً لمدة 4 أيام أو 8 أسابيع. بعد فترات العلاج، تم ذبح الفئرخ وتشريح المسالك المعوية بالكامل للتصوير الفلوري خارج الجسم باستخدام نظام تصوير متعدد الفلورة.

النتائج الرئيسية

• البناء والتعبير: تم إنتاج السلالة المعاد تركيبها (mCherry-L3) بنجاح. أكد الـ PCR والتسلسل إدراج الجين، وأكد تحليل "وسترن بلوت" التعبير البروتيني. أظهر المجهر البؤري الفلوري الأحمر بوضوح مع عدم وجود تغييرات ملحوظة في الشكل العصوي مقارنة بالسلالة البرية.
• النمو والاستقرار: كان منحنى نمو mCherry-L3 مماثلاً تقريباً للسلالة البرية، مما يشير إلى أن التوسيم لم يعق التكاثر. بلغت شدة الفلورة ذروتها بعد 16 ساعة من التحفيز. والأهم من ذلك، حافظت السلالة على فلورة حمراء قابلة للكشف وظل تسلسل جين mCherry مستقراً عبر 98 جيلاً من التمرير المتسلسل.
• التأثير الفسيولوجي: بينما احتفظت السلالة الموسومة بالقدرة على تحمل ظروف الجهاز الهضمي المحاكية بشكل مشابه للسلالة البرية، إلا أن نشاطها المضاد للميكروبات ضد Staphylococcus aureus انخفض بشكل ملحوظ (P < 0.05). وظل النشاط ضد البكتيريا المؤشرة الأخرى دون تغيير إحصائي.
• التوزيع المعوي:
  • الإعطاء لمدة 4 أيام: تم اكتشاف الفلورة في جميع أنحاء المسلك المعوي، لكنها كانت أكثر بروزاً في الاثني عشر، مع إشارات ملحوتا في الأعور والقولون.
  • الإعطاء لمدة 8 أسابيع: كانت إشارات الفلورة أقوى بصرياً وأكثر انتشاراً عبر المسلك المعوي بأكمله مقارنة بمجموعة الـ 4 أيام.

الأهمية والادعاءات
يزعم البحث أنه نجح في إنشاء سلالة L. plantarum L3 موسومة بـ mCherry ومحفزة، والتي تعمل كأداة صالحة لتصور التوزيع المعوي أثناء الإعطاء الفموي المتكرر. وتوضح الدراسة أن عملية التوسيم تحافظ على خصائص نمو السلالة وتحملها للجهاز الهضمي، رغم أنها قد تغير بعض الخصائص المضادة للميكروبات.

يؤكد المؤلفون أن الاختلافات الملحوظة في توزيع الفلورة بين مجموعتي الـ 4 أيام والـ 8 أسابيع توفر أساساً للتحقيق في استمرار البكتيريا والتفاعلات بين المضيف والميكروبات بمرور الوقت. ومع ذلك، يحافظ البحث صراحة على نطاق متواضع فيما يتعلق بهذه النتائج:

• يُقدم التوزيع الفلوري الأوسع الملاحظ بعد 8 أسابيع كدليل على الوجود الواسع أثناء الإعطاء المستمر، وليس كدليل على الاستعمار المستقر طويل الأمد المستقل عن الجرعات.
• لم تقيم الدراسة النتائج الفسيولوجية للمضيف أو فعالية البروبيوتيك؛ لذا لا ينبغي تفسير أنماط التوزيع كمؤشرات على تعزيز النشاط البروبيوتيكي.
• يقر المؤلفون بوجود قيود، بما في ذلك عدم وجود فترة غسيل (washout period) بعد الإعطاء، والطبيعة النوعية للتصوير، وغياب تأكيد الحيوية لجميع المواد الفلورية المكتشفة. ويخلصون إلى أنه بينما تعد mCherry-L3 أداة تجريبية مفيدة لدراسات التوزيع، فإن العمل المستقبلي الذي يتضمن الكشف الكمي وأخذ العينات بعد الإعطاء مطلوب لتحديد استمرار البكتيريا واستعمارها بدقة.