Evaluation of Bacillus velezensis SM6 isolated from Solea solea: A score-heat map based approach for the selection of probiotic feed additives
تحدد هذه الدراسة سلالة *Bacillus velezensis* SM6، المعزولة من سمك موسى الشائع، كمرشح متميز للمعينات الحيوية (البروبيوتيك) في مجال الاستزراع المائي عبر توظيف نهج مبتكر يعتمد على الخريطة الحرارية للدرجات لتقييم سلامتها، ونشاطها المضاد للميكروبات واسع الطيف، وخصائص الالتصاق القوية لديها، والتي تم التحقق من صحتها لاحقاً من خلال تجارب حيوية في سمك القاروص الأوروبي.
المؤلفون الأصليون:Mouna JLIDI, Luis Monzón-Atienza, Eya Frikha, Antonio Gómez-Mercader, Zouhour Said, Nicolás López-Guerrero, Nicolás Cabrera-Guerle, Sana Bardaa, Asmahen Akremi, Manel Ben Ali, Félix Acosta Arbelo, MamMouna JLIDI, Luis Monzón-Atienza, Eya Frikha, Antonio Gómez-Mercader, Zouhour Said, Nicolás López-Guerrero, Nicolás Cabrera-Guerle, Sana Bardaa, Asmahen Akremi, Manel Ben Ali, Félix Acosta Arbelo, Mamdouh Ben Ali
المؤلفون الأصليون: Mouna JLIDI, Luis Monzón-Atienza, Eya Frikha, Antonio Gómez-Mercader, Zouhour Said, Nicolás López-Guerrero, Nicolás Cabrera-Guerle, Sana Bardaa, Asmahen Akremi, Manel Ben Ali, Félix Acosta Arbelo, Mamdouh Ben Ali
أصبحت تربية الأسماك ركيزة أساسية في إنتاج الغذاء العالمي، حيث سدت الفجوة التي خلفتها تضاؤل المخزونات السمكية البرية. ومع ذلك، فإن الظروف المزدحمة لمزارع الأحياء المائية الحديثة تخلق "عاصفة مثالية" للأمراض. فعندما تتعرض الأسماك للإجهاد، يمكن للبكتيريا الضارة أن تنتشر بسرعة، مما يؤدي إلى خسائر فادحة. ولعقود من الزمن، اعتمدت الصناعة على المضادات الحيوية لمحاربة هذه العدوى، لكن هذا النهج يحمل ثمنًا باهظًا؛ إذ يؤدي الإفراط في استخدام هذه العقاقير إلى نشوء بكتيريا مقاومة تهدد البيئة وصحة الإنسان معًا، كما يخل بالميكروبات النافعة الطبيعية التي تعيش داخل الأسماك. وفي البحث عن مسار أكثر أمانًا، يتجه العلماء نحو "البروبيوتيك" (المعينات الحيوية) — وهي كائنات دقيقة حية، عند إضافتها إلى العلف، يمكنها طرد البكتيريا الضارة وتعزيز دفاعات الأسماك الخاصة. ويكمن التحدي في العثور على النوع المناسب من الميكروبات: نوع يتمتع بالصلابة الكافية للنجاة من الرحلة القاسية عبر الجهاز الهضمي للسمكة، والقوة الكافية لمحاربة مسببات الأمراض، والأمان التام للحيوان الذي يُفترض به حمايته.
لقد شرع باحثون من تونس وإسبانيا في حل هذا اللغز من خلال البحث عن إجابات في مكان غير متوقع: جلد وأمعاء سمك "السيلا" (السمك المفلطح) البري، وهو نوع من الأسماك المفلطحة الموجودة في البحر الأبيض المتوسط. وبدلاً من التخمين حول أي البكتيريا قد تكون فعالة، جمعوا عينات من الأسماك وبدأوا عملية فحص صارمة. فقد عزلوا 87 سلالة بكتيرية مختلفة من المخاط والأمعاء لهذه الأسماك البرية. ومن هذه المجموعة الكبيرة، حصروا تركيزهم في ثماني سلالات أظهرت قدرة ملحوطة على محاربة مجموعة واسعة من مسببات الأمراض الخطيرة لدى الأسماك. ثم وضعت هذه السلالات الثماني المرشحة تحت اختبار "المنخل" المصمم لقياس مدى فائدتها وسلامتها. حيث بحث العلماء في مدى قدرة البكتيريا على الالتصاق بأنسجة الأسماك، ومدى فعاليتها في إنتاج الإنزيمات الهاضمة، وما إذا كان بإمكانها تعطيل الإشارات الكيميائية التي تستخدمها البكتيريا لتنسيق هجماتها. والأهم من ذلك، أنهم تحققوا أيضًا من وجود أي علامات خطر، مثل القدرة على تدمير خلايا الدم أو حمل جينات تسبب الأمراض.
ولتحليل هذا الكم الهائل من البيانات، طور الفريق نظام تسجيل يزن كل سمة إيجابية مقابل كل خطر محتمل. فقد خصصوا نقاطًا للسلوكيات المفيدة، مثل الالتصاق القوي بالمخاط أو القدرة على تفكيك السموم البكتيرية، وطرحوا نقاطًا لأي مخاوف تتعلق بالسلامة. سمحت هذه الطريقة لهم بتصور أداء كل سلالة على خريطة واحدة، مما كشف عن فائز واضح. وقد برزت سلالة واحدة، تم تحديدها باسم Bacillus velezensis SM6، فوق جميع السلالات الأخرى؛ حيث حققت أعلى درجة ممكنة من خلال الجمع بين الحماية واسعة النطاق ضد الأمراض والقدرة الاستثنائية على الالتصاق بأسطح الأسماك. وفي الاختبارات المعملية، أظهرت هذه البكتيريا طبيعة "كارهة للماء" (طاردة للماء) بنسبة 78.28 بالمائة، مما يساعدها على الالتصاق بجدار أمعاء السمكة. كما أظهرت قدرة بنسبة 92 بالمائة على التكتل مع بعضها البعض، وهي سمة تساعدها على استعمار الأمعاء وإقصاء الغزاة.
وكان ملف السلامة لهذا المرشح الأول لا يقل إثارة للإعجاب عن قدرته القتالية. فبينما أظهرت سلالات أخرى علامات ضرر محتمل، مثل القدرة على تكسير خلايا الدم أو حمل جينات الضراوة، كانت سلالة Bacillus velezensis SM6 "نظيفة". فقد أظهرت عدم وجود أي علامات سمية، ولم تحمل أي جينات معروفة مسببة للأمراض، وظلت حساسة للمضادات الحيوية الشائعة، مما يعني أنها لن تساهم في مشكلة مقاومة الأدوية المتزايدة. وللتأكد من هذه النتائج، اتخذ الباحثون الخطوة الأخيرة، حيث قاموا بحقن البكتيريا في أسماك "القاروص الأوروبي". وعلى مدار عشرة أيام، لم تظهر على الأسماك أي علامات مرض، ولا حالات نفوق، ولا تشوهات جسدية. لم تسبب البكتيريا أي ضرر للأسماك، مما أثبت أن هذه السلالة آمنة للاستخدام في حيوان حي.
تخلص الدراسة إلى أن Bacillus velezensis SM6 تمثل مرشحًا واعدًا للغاية لمستقبل تربية الأسماكن المستدامة. فمن خلال استخدام منهج يوازن بعناية بين الأداء الوظيفي وفحوصات السلامة الصارمة، حدد الباحثون ميكروبًا يمكن أن يحل محل المضادات الحيوية الضارة. هذه البكتيريا، التي عُزلت من سمك "السيلا" البري، لديها القدرة على حماية الأسماك المستزرعة من الأمراض مع الحفاظ على صحة البيئة المائية. ويشير العمل إلى أن أفضل "البروبيوتيك" قد لا يأتي من المختبر، بل من الأنظمة البيئية التي تعيش فيها الأسماك، مما يقدم حلاً طبيعيًا لواحد من أكثر المشكلات استمرارًا في مجال تربية الأحياء المائية. وبينما تبرز الحاجة إلى مزيد من الدراسات لاختبار فعاليتها في عمليات الزراعة واسعة النطاق، فإن هذا الاكتشاف يمثل خطوة مهمة نحو طريقة أكثر أمانًا واستدامة لإطعام سكان العالم المتزايدين.
بيان المشكلة تواجه تربية الأحياء المائية تحديات كبيرة ناتجة عن تفشي البكتيريا الممرضة، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية من خلال تقليل النمو، وإضعاف المناعة، وارتفاع معدلات النفوق. إن الاعتماد التقليدي على المضادات الحيوية والعلاجات الكيميائية أدى إلى ظهور بكتيريا مقاومة، وتلوث بيئي، واختلال في الميكروبيوتا النافعة للمضيف. وبينما توفر البروبيوتيك بديلًا مستدامًا، فإن طرق الفرز الحالية غالبًا ما تعاني من قيود: فقد تعتمد على طرق طرح (subtractive methods) تستبعد السلالات دون النظر في كامل إمكاناتها، أو تستخدم التجميع غير الخاضع للإشراف (مثل تحليل المكونات الرئيسية PCA، والخرائط الحرارية) التي تعطي الأولوية للمعايير الوظيفية مع عدم دمج معايير السلامة الحرجة بشكل كافٍ. هناك حاجة إلى إطار عمل شامل ومتعدد الأبعاد يقيم في آن واحد الفعالية الوظيفية والسلامة الحيوية لاختيار مرشحي بروبيوتيك قويين من مصادر غير مستكشفة، مثل ميكروبيوتا الأسماك البحرية مثل سمك موسى الشائع (Solea solea).
المنهجية استخدمت الدراسة عملية فرز واختيار صارمة متعددة المراحل شملت 87 سلالة بكتيرية معزولة من المخاط الجلدي والأمعاء لسمك Solea solea البري.
العزل والفرز الأولي: تم عزل السلالات عبر المعالجة الحرارية لاختيار مكونات الأبواغ. استخدم الفرز الأولي طريقة غطاء المستعمرة (colony overlay) ضد خمس ممرضات سمكية قوية (Vibrio anguellarum، وV. harveyi، وAeromonas hydrophila، وLactococcus garvieae، وPhotobacterium damselae). تم اختيار ثماني سلالات أظهرت نشاطًا مضادًا بنسبة 100% لمزيد من التقييم.
التوصيف الوظيفي: تم تقييم السلالات المختارة من حيث:
النشاط المضاد للميكروبات: باستخدام الرواسب الخلوية (CFS) ضد مجموعة أوسع من الممرضات، مع اختبارات الاستقرار ضد الحرارة وبروتيناز K لتحديد طبيعة المركبات النشطة.
إخماد النصاب (Quorum Quenching) ومضادات الغشاء الحيوي (Biofilm): تقييم تحلل جزيئات AHL (سلسلة قصيرة وطويلة) وتثبيط تكوين الغشاء الحيوي الموجود والقائم.
الملف الإنزيمي: فحص إنتاج الأميليز، والليباز، والبروتياز.
التحمل الهضمي: اختبارات حيوية تحت ظروف سوائل المعدة المحاكية (pH 2.0–3.0) والسوائل المعوية، والتعرض لعصارة السمك ومرارة الثدييات (Oxgall).
خصائص الالتصاق: قياس التجمع الذاتي، والتجمع المشترك مع الممرضات، وكره السطح الخلوي (باستخدام التولوين، وإيثيل الأسيتات، والكلوروفورم)، والالتصاق بالمخاط (سمك موسى والسمك متعدد القشور)، وBSA، والبولي ستيرين.
تقييم السلامة:
في المختبر (In Vitro): فحص PCR للبحث عن جينات الضراوة والسموم (مثل السموم المعوية، ومنزعات الأمينات الحيوية)، واختبارات النشاط الانحلالي للدم، واختبار حساسية المضادات الحيوية.
في الكائن الحي (In Vivo): تجربة سلامة حيوية تتضمن الحقن داخل الصفاق في سمك القاروص الأوروبي (Dicentrarchus labrax) لمراقبة النفوق والعلامات السريرية لمدة 10 أيام.
إطار الاختيار: تم تنفيذ نهج الخريطة الحرارية للدرجات (score-heat map approach) المبتكر. تم تخصيص درجات عددية لكل سلالة بناءً على النتائج التجريبية لكل من المعايير الوظيفية (النشاط المضاد للبكتيريا، الإنزيمات، الالتصاق، إلخ) ومعايير السلامة (الانحلال الدموي، مقاومة المضادات الحيوية، جينات الضراوة). استُخدم التجميع الهرمي والخرائط الحرارية لتصنيف السلالات بشكل موضوعي. كما أُجري تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتحليل الحساسية للتحقق من قوة نظام تسجيل الدرجات.
التحديد: تم تحديد المرشح الأفضل باستخدام تقنية MALDI-TOF لكتلة الطيف وتسلسل جين 16S rRNA.
النتائج الرئيسية
اختيار السلالة: من بين 87 عزلة، أظهرت ثماني سلالات نشاطًا مضادًا قويًا. ومن بينها، برزت السلالة SM6 كمرشح متفوق.
الأداء الوظيفي:
النشاط المضاد للميكروبات: أظهرت SM6 تثبيطًا واسع النطاق ضد جميع الممرضات المختبرة. فُقد نشاطها جزئيًا أو كليًا بعد المعالجة بالحرارة وبروتيناز K، مما يشير إلى أن المركبات النشطة هي مركبات بروتينية وحساسة للحرارة.
إخماد النصاب والغشاء الحيوي: أظهرت SM6 تحللًا كبيرًا لـ AHL (سلسلة C6 وC12) وثبطت بفعالية تكوين الغشاء الحيوي والحركة في V. anguellarum وV. harveyi.
الالتصاق والتجمع: أظهرت SM6 تجمعًا ذاتيًا استثنائيًا (92% للخلايا الخضرية، 67% للأبواغ) وتجمعًا مشتركًا مع الممرضات (يصل إلى 97%). كما امتلكت كرهًا سطحيًا عاليًا (78.28% مع إيثيل الأسيتات) وأعلى معدلات الالتصاق بالمخاط المعوي والجلدي (>60%).
التحمل: حافظت كل من الخلايا الخضرية والأبواغ لـ SM6 على حيوية عالية (>80%) تحت الظروف الحمضية، وسوائل المعدة/الأمعاء المحاكية، والتعرض للمرارة.
ملف السلامة:
السلامة الجينية والنمطية: كانت SM6 سالبة لجميع جينات الضراوة والسموم المختبرة. أظهرت انحلالًا من النوع γ (غير منحل للدم) وكانت حساسة لجميع المضادات الحيوية المختبرة.
السلامة في الكائن الحي: في تجربة D. labrax، لم تسبب SM6 أي نفوق أو علامات سريرية، على عكس عدة سلالات أخرى مختبرة أدت إلى بعض حالات النفوق.
التحديد: تم تحديد SM6 على أنها Bacillus velezensis.
نتيجة تسجيل الدرجات: في تحليل الخريطة الحرارية للدرجات، حققت SM6 أعلى إجمالي درجات، وشكلت مجموعة متميزة منفصلة عن السلالات التي امتلكت فوائد وظيفية ولكنها فشلت في معايير السلامة (مثل السلالتين I24 وI11). أكد تحليل الحساسية تصنيف SM6 المتسق في المرتبة الأولى عبر سيناريوهات مختلفة.
الأهمية والادعاءات يزعم البحث أن نهج الخريطة الحرارية للدرجات المقترح نجح في التغلب على قيود طرق الفرز السابقة من خلال دمج معايير السلامة مباشرة في عملية الاختيار جنبًا إلى جنب مع المعايير الوظيفية. سمح هذا الإطار متعدد الأبعاد بالتحديد الموضوعي لـ Bacillus velezensis SM6 كمرشح بروبيوتيك واعد للغاية.
يؤكد المؤلفون أن SM6 تمثل مرشحًا متوازنًا يتميز بـ:
تثبيط واسع النطاق للممرضات.
قدرة استعمار قوية (التصاق وتجمع عاليين).
ملف سلامة موثق (غياب جينات الضراوة، عدم انحلال الدم، الحساسية للمضادات الحيوية، والأمان في الكائن الحي).
تخلص الدراسة إلى أن Bacillus velezensis SM6، التي تم اختيارها من خلال هذا الإطار الصارم، تمتلك إمكانات كبيرة لتعزيز الاستدامة في تربية الأحياء المائية من خلال تقديم بديل للمضادات الحيوية. ومع ذلك، يشير المؤلفون بتواضع إلى أنه بينما تعد السلالة آمنة وواعدة وظيفيًا، فإن المزيد من الدراسات في الكائن الحي (in vivo) مطلوبة للتحقق من فعاليتها في بيئات الإنتاج الفعلية لتربية الأحياء المائية.