High Resolution Multi-Pass Astral Analyzer Quantification Enables Highly Multiplexed 35-Plex Tandem Mass Tag Proteomics

Die Studie stellt eine neuartige „TMT HR"-Modus-Methode für das Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom-Massenspektrometer vor, die durch eine dreifache Ionenpfadverlängerung die erforderliche Auflösung für eine präzise Quantifizierung in 35-fach multiplexen Tandem-Mass-Tag-Proteomik-Experimenten ermöglicht und dabei eine tiefere Analyse als herkömmliche Orbitrap-Methoden bei vergleichbarer Präzision zu Goldstandard-MS3-Verfahren bietet.

Das Wesentliche

Das große Problem: Zu viele Gäste auf einer kleinen Party

Stellen Sie sich vor, Sie sind ein Detektiv, der versuchen muss, die Stimmen von 35 verschiedenen Gästen in einem vollen Raum zu hören. Jeder Gast trägt ein farbiges Armband (das sind die „TMT-Markierungen" aus dem Papier). Wenn Sie einen Gast ansprechen, antworten alle 35 gleichzeitig mit einem kurzen „Hallo!".

Das Problem ist: Diese „Hallo!"-Rufe sind fast identisch. Sie unterscheiden sich nur winzig, fast wie zwei fast gleiche Noten auf einem Klavier.

• Früher: Man konnte nur 18 Gäste gleichzeitig hören.
• Jetzt: Man will 35 Gäste hören.
• Das Hindernis: Um diese winzigen Unterschiede zu erkennen, braucht man ein extrem scharfes „Ohr" (eine hohe Auflösung im Massenspektrometer). Die bisherigen Geräte waren wie ein normales Telefon: Sie hörten die 35 Stimmen, aber sie verschwammen zu einem unverständlichen Rauschen. Besonders bei den neuen 35-Gäste-Partys (35-Plex) war das Gerät überfordert.

Die Lösung: Der „Super-Laufsteg" (Multi-Pass-Modus)

Die Forscher vom Team um Hamish Stewart haben eine clevere Lösung gefunden. Sie haben das Gerät (ein Massenspektrometer namens „Orbitrap Astral") so umgebaut, dass die Ionen (die kleinen Boten, die die Stimmen tragen) nicht nur einmal durch das Gerät fliegen, sondern dreimal.

Stellen Sie sich das so vor:

• Normaler Modus: Ein Läufer rennt eine 100-Meter-Strecke. Er kommt schnell an, aber man kann ihn nicht genau vermessen, weil er zu schnell ist.
• Der neue „TMT HR"-Modus: Der Läufer muss die Strecke dreimal laufen (insgesamt 300 Meter).
  • Der Vorteil: Durch die längere Strecke kann man den Läufer viel genauer beobachten und unterscheiden, ob er 1,70 m oder 1,71 m groß ist. Das Gerät wird zum „Super-Ohr".
  • Der Nachteil: Es dauert länger, bis der Läufer fertig ist.

Der Trick: Zwei Aufgaben, zwei Schritte

Da das „Dreifach-Rennen" (Multi-Pass) länger dauert und man nicht alles gleichzeitig messen kann, haben die Forscher einen cleveren Zwei-Schritte-Plan entwickelt:

1. Schritt 1 (Das schnelle Foto): Das Gerät macht einen schnellen Scan, um zu sehen, wer da ist (welche Proteine). Das ist wie ein schnelles Foto, um die Gäste zu identifizieren.
2. Schritt 2 (Das genaue Zuhören): Erst danach schaltet das Gerät in den „Super-Laufsteg"-Modus. Jetzt rennen die Boten dreimal durch, um die Stimmen (die TMT-Markierungen) so genau wie möglich zu zählen.

Warum ist das genial?
Früher musste man sich entscheiden: Entweder man identifiziert die Gäste schnell (aber zählt sie falsch) oder man zählt sie genau (aber verpasst viele Gäste). Mit diesem neuen Trick macht man beides: Man identifiziert schnell und zählt dann extrem genau.

Was haben sie herausgefunden?

Die Forscher haben das System mit echten Proben getestet (Hefe und menschliche Zellen):

• Mehr Tiefe: Mit dem neuen Modus konnten sie über 4.500 Proteine in einer Probe zählen. Mit dem alten Modus (ohne den „Dreifach-Lauf") waren es bei der komplexen 35-Gäste-Party nur noch 10 Proteine, weil das Gerät verwirrt war.
• Genauigkeit: Die Ergebnisse waren so präzise wie die „Gold-Standard"-Methoden, die normalerweise viel langsamer und teurer sind.
• Der „Low-Input"-Boost: Sie haben das Gerät noch empfindlicher gemacht (wie eine Lupe, die das Licht verstärkt). Dadurch konnten sie sogar bei sehr kleinen Proben (wie einzelnen Zellen) die Anzahl der gefundenen Proteine verdoppeln.

Zusammenfassung in einem Satz

Die Forscher haben einen Trick entwickelt, bei dem die Boten im Massenspektrometer dreimal durch den Laufsteg geschickt werden, um winzige Unterschiede zwischen 35 verschiedenen Proben zu erkennen – und das, ohne dabei die Geschwindigkeit und die Menge der gefundenen Informationen zu verlieren.

Das Ergebnis: Wir können jetzt viel mehr Proteine gleichzeitig und genauer messen als je zuvor. Das ist wie ein Upgrade von einem einfachen Hörgerät zu einem hochauflösenden Surround-Sound-System für die Biologie.

Technische Zusammenfassung

Titel: Hochauflösende Multi-Pass-Astral-Analyse ermöglicht hochmultiplexierte 35-plex Tandem-Mass-Tage-Proteomik

1. Problemstellung

Tandem-Mass-Tags (TMT) sind ein etabliertes Werkzeug für die hochmultiplexierte und präzise quantitative Proteomik. Die Einführung neuer TMTpro-Reagenzien mit deuterierten Reporter-Kanälen hat die Multiplex-Kapazität von 18 auf 35 erhöht. Diese neuen Tags erzeugen Reporter-Ionen in Quadruplets mit einem sehr geringen Massenabstand von nur 3 mDa.

• Herausforderung: Um diese Ionen bei m/z 128 zu trennen und zu quantifizieren, ist eine Auflösung von ca. 100.000 erforderlich.
• Limitierung bestehender Systeme: Herkömmliche Single-Reflection-Time-of-Flight-Analysatoren (wie das Astral-System im Standardbetrieb) erreichen zwar hohe Auflösungen (ca. 55k–70k), reichen jedoch für die Trennung der 35-plex-Quadruplets nicht aus. Zudem führt der "Raumladungseffekt" (Space Charge) bei hohen Ionenanzahlen zu einer Verschlechterung der Auflösung.
• Konflikt: Eine Multi-Pass-Betriebsart (Mehrfachdurchläufe) im Astral-Analysator würde die Auflösung theoretisch verdoppeln, war jedoch bisher mit der TMT-Analyse unvereinbar, da sie den messbaren Massenbereich einschränkt und die Identifizierung von Peptid-Fragmenten (für die Sequenzierung) unmöglich macht, da die Flugzeit für unbekannte Ionen mehrdeutig wird.

2. Methodik

Die Autoren entwickelten eine neue Methode für das Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ Zoom Massenspektrometer, die die Vorteile des Astral-Analysators mit einer neuartigen Betriebsart kombiniert.

• Multi-Pass-Modus ("TMT HR Mode"):

  • Der Astral-Analysator wird so konfiguriert, dass Ionen nach der Injektion nicht sofort detektiert werden, sondern durch einen speziellen Prismen-Deflektor (Relay Prism) in einen "Fang-Modus" (Trapping Mode) gelenkt werden.
  • Die Ionen durchlaufen den Multi-Reflection-Pfad dreimal (3 volle Umläufe), was die Flugstrecke von 30 m auf 90 m verlängert.
  • Dies führt zu einer mehr als verdoppelten Auflösung für einen spezifischen, engen m/z-Bereich (die Reporter-Ionen).
  • Ein schnelles Umschalten des Deflektors (innerhalb von 20 µs) ermöglicht die Extraktion der Ionen nach dem dritten Durchlauf.

• Zweistufiger MS2-Ansatz:
  Da der Multi-Pass-Modus nicht für die Identifizierung unbekannter Peptid-Fragmente geeignet ist, wurde ein geteilter Scan-Ansatz entwickelt:

  1. Scan 1 (Identifikation): Ein regulärer MS2-Scan im Single-Pass-Modus des Astral-Analysators zur Sequenzierung und Identifizierung der Peptide.
  2. Scan 2 (Quantifizierung): Ein zweiter MS2-Scan im TMT HR Mode (Multi-Pass), der sich ausschließlich auf die hochauflösende Quantifizierung der bekannten Reporter-Ionen konzentriert.

• Technische Anpassungen:

  • Fokus-Korrektur: Um die durch den Multi-Pass-Modus verursachte Verschiebung der Fokusebene schnell zu korrigieren (ohne langsame Hochspannungs-Anpassungen), wurde eine Kompensationsspannung an einer bestehenden Elektrode (ca. -30 V) verwendet.
  • Raumladungstoleranz: Der Modus wurde so abgestimmt, dass er eine hohe Ionenkapazität toleriert, auch wenn die Auflösung bei sehr hohen Ionenmengen leicht sinkt.
  • Low Input Mode: Für geringe Probenmengen wurde der Detektorverstärkung erhöht, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

3. Wichtige Beiträge

• Entwicklung des "TMT HR Mode": Erste erfolgreiche Implementierung einer Multi-Pass-Betriebsart auf einem kommerziellen Orbitrap-Astral-System, die speziell für die Trennung von 35-plex TMT-Reporter-Ionen optimiert ist.
• Hybride Scan-Strategie: Lösung des Konflikts zwischen Identifikation (benötigt breiten Massenbereich, Single-Pass) und Quantifizierung (benötigt hohe Auflösung, Multi-Pass) durch zeitlich getrennte, gepaarte Scans.
• Kalibrierung und Stabilität: Bewältigung der technischen Herausforderungen bei der schnellen Umschaltung zwischen Betriebsmodi und der Kompensation von Raumladungseffekten.

4. Ergebnisse

Die Methode wurde an verschiedenen Proben getestet:

• Auflösungsfähigkeit: Der Modus konnte erfolgreich TMTpro-Reporter-Ion-Quadruplets (3 mDa Abstand) bei Ionenmengen von 500–1000 Ionen trennen, mit einer Auflösung von >90.000.
• HeLa-Proben (32-plex):
  • Im Standard-Modus (Single-Pass) kollabierte die Anzahl der quantifizierbaren Proteine bei komplexen 32-plex-Proben auf nur 10, da die Peaks nicht aufgelöst wurden.
  • Mit dem TMT HR Mode wurden >4.500 Protein-Gruppen quantifiziert.
  • Die gemessenen Konzentrationsverhältnisse (1:4) wurden präzise wiedergegeben, ohne signifikante Crosstalk-Effekte.
• Hefe-Proben (11-plex): Bei einfacheren Proben (TKO Hefe) zeigte der TMT HR Mode keine Einbußen in der analytischen Tiefe im Vergleich zum regulären Orbitrap-Astral-Verfahren.
• Low Input Mode: Die Aktivierung des Low Input Modes erhöhte das Signal-Rausch-Verhältnis der Reporter-Kanäle von <50 auf >130 und steigerte die Anzahl der quantifizierten Proteine um über 50 % (von 1.750 auf 2.750).
• Vergleich mit dem "Goldstandard" (Orbitrap Eclipse MS3):
  • In einem 35-plex-Experiment (2 Zelllinien) quantifizierte der TMT HR Mode 2.320 Proteine, während das Orbitrap Eclipse mit RTS-SPS-MS3 nur 1.330 Proteine lieferte.
  • Die quantitative Präzision (gemessen via PCA) war mit der MS3-Methode vergleichbar, wobei der TMT HR Mode durch die höhere Geschwindigkeit des Astral-Analysators weniger durch Retentionszeit-Verschiebungen (Deuterium-Effekt) beeinflusst wurde.

5. Bedeutung und Ausblick

• Durchbruch in der Multiplexing-Kapazität: Die Arbeit ermöglicht erstmals die zuverlässige Quantifizierung von 35-plex TMT-Proben auf einem einzelnen Massenspektrometer, ohne auf langsame MS3-Methoden angewiesen zu sein.
• Steigerung des Durchsatzes: Die Methode bietet eine deutlich höhere analytische Tiefe als herkömmliche Orbitrap-only-Methoden und ist schneller als MS3-basierte Ansätze.
• Anwendungsgebiet: Besonders wertvoll für komplexe Proteomik-Studien, die hohe Multiplexing-Faktoren erfordern, sowie für Low-Input- und Einzelzell-Analysen, wo die Kombination aus hoher Empfindlichkeit (Astral) und hoher Multiplexing-Kapazität entscheidend ist.
• Zukunftspotenzial: Die Multi-Pass-Technologie könnte zukünftig auch für hochauflösende MS1-Scans oder andere Anwendungen genutzt werden, die eine extrem hohe Auflösung in einem begrenzten Massenbereich erfordern.

Zusammenfassend demonstriert diese Studie, wie durch innovative Instrumentenmodifikationen (Multi-Pass im Astral) und angepasste Datenakquisitionsstrategien die Grenzen der aktuellen Hochdurchsatz-Proteomik verschoben werden können.