Scaling-Up Vertical-Wheel Bioreactors Based on Cell Aggregate Exposure to Shear Stress and Energy Dissipation Rate

Diese Studie zeigt, dass die Skalierung vertikaler Rad-Bioreaktoren für menschliche pluripotente Stammzellen auf der basischen, trajectorienbasierten Exposition gegenüber Energiedissipationsraten (EDR) und nicht auf volumetrischen Durchschnittswerten oder Scherspannungen beruhen sollte, da die EDR die Aggregation und Gesamtwachstumsrate maßgeblich beeinflusst.

Das Wesentliche

Das große Problem: Wie man Millionen von Zellen großzieht

Stellen Sie sich vor, Sie wollen eine riesige Armee von „Reparatur-Zellen" (Stammzellen) herstellen, um ein krankes Herz zu heilen. Das Problem ist: Diese Zellen sind sehr empfindlich. Wenn Sie sie in einem großen Becken (einem Bioreaktor) herumwirbeln, damit sie sich vermehren, können sie durch die Bewegung verletzt werden oder sich zu großen Klumpen zusammenballen, die nicht mehr genug Sauerstoff bekommen.

Die Forscher wollten herausfinden: Wie muss man das Wasser im Becken bewegen, damit die Zellen gesund und zahlreich bleiben, auch wenn man von einem kleinen Becken auf ein riesiges Becken umsteigt?

Die Lösung: Der „Vertikale Rad-Bioreaktor"

Statt eines normalen Rührers (wie ein Mixer im Keller) nutzen sie einen Vertikalen Rad-Bioreaktor.

• Die Analogie: Stellen Sie sich ein Wasserrad vor, das senkrecht im Wasser steht und sich dreht. Es ist wie ein riesiges, sich drehendes Laufrad in einem Fitnessstudio, nur dass es im Wasser liegt und die Zellen mitnimmt.
• Der Vorteil: Es bewegt das Wasser sanfter und gleichmäßiger als ein normaler Rührer.

Der Trick: Nicht nur das Wasser schauen, sondern die Zellen!

Früher haben Wissenschaftler geschaut: „Wie stark ist die Strömung im ganzen Becken im Durchschnitt?"

• Das Problem: Das ist wie zu sagen: „Der Durchschnittstemperatur im ganzen Haus ist 20 Grad." Aber das ist trügerisch! Im Keller ist es kalt, im Dachboden heiß. Wenn Sie ein kleines Eiswürfelchen (die Zelle) durch das Haus tragen, erfährt es extreme Kälte und extreme Hitze, auch wenn der „Durchschnitt" harmlos ist.

Die Forscher haben einen neuen Weg gewählt: Sie haben die Zellen virtuell „verfolgt".

• Die Analogie: Statt nur den Durchschnitt zu messen, haben sie sich 100 unsichtbare Kameras an die Zellen geklebt und mitverfolgt, wo sie hinkommen.
• Sie haben gesehen: Eine kleine Zelle (wie ein Staubkorn) wird vom Wasser leicht mitgerissen und flattert überall herum. Eine große Zelle (wie ein Stein) sinkt schneller nach unten und wird vom Wasser anders bewegt.
• Die Erkenntnis: Was die Zelle wirklich spürt (die „Geschichte" ihrer Reise), ist völlig anders als der Durchschnittswert im Becken.

Was haben sie herausgefunden?

1. Größe zählt: Je größer die Zell-Klumpen werden, desto mehr sinken sie nach unten und erleben dort mehr „Stress" (Scherkräfte), weil das Rad dort am schnellsten dreht.
2. Die Geschwindigkeit des Rades: Wenn man das Rad zu langsam dreht, setzen sich die Zellen ab. Wenn es zu schnell dreht, werden sie wie in einem Sturm zerkleinert.
   • Der Goldilocks-Effekt: Es gibt eine „just-right"-Geschwindigkeit (hier 40 Umdrehungen pro Minute), bei der die Zellen am besten wachsen und die kleinsten Klumpen bilden.
3. Der Vergleich: Wenn man von einem kleinen Becken (100 ml) auf ein großes (500 ml) wechselt, reicht es nicht, einfach nur die gleiche Durchschnitts-Stärke einzustellen. Man muss die Reise der Zellen im großen Becken so gestalten, dass sie die gleichen Erfahrungen machen wie im kleinen.

Das Fazit für die Zukunft

Die Forscher sagen: Vergessen Sie den Durchschnitt!

Wenn man Stammzellen in großen Mengen für Therapien herstellen will, darf man nicht einfach sagen: „Wir stellen die gleiche Rührgeschwindigkeit ein." Stattdessen muss man berechnen, wie sich die Zellen durch das Becken bewegen und welche Kräfte sie auf ihrem Weg wirklich spüren.

Zusammengefasst in einem Satz:
Um Millionen von empfindlichen Zellen zu züchten, muss man nicht nur das Becken designen, sondern die „Reiseroute" der Zellen so planen, dass sie nicht in den stürmischen Ecken landen, sondern sanft durch das Becken gleiten – egal ob das Becken groß oder klein ist.

Technische Zusammenfassung

Titel: Hochskalierung von Vertical-Wheel-Bioreaktoren basierend auf der Scherstress- und Energiedissipationsrate-Exposition von Zellaggregaten

1. Problemstellung

Für klinische Anwendungen, insbesondere bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen durch die Transplantation von menschlichen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs), werden große Mengen an hPSCs benötigt. Die herkömmliche Herstellung in statischen 2D- oder 3D-Systemen stößt an Grenzen hinsichtlich Skalierbarkeit und Kosten. Suspensionkulturen in Bioreaktoren bieten eine vielversprechende Alternative, da sie hohe Zellmengen bei Erhalt der Pluripotenz ermöglichen.

Ein zentrales Problem bei der Skalierung von Bioreaktoren (z. B. von 100 mL auf 500 mL) ist die Aufrechterhaltung eines konsistenten mechanischen Umfelds. Traditionelle Skalierungsansätze basieren oft auf Euler'schen Kennzahlen wie dem volumenmittelten Energiedissipationsrate (EDR), der maximalen Scherstress oder der Rührergeschwindigkeit. Die Autoren argumentieren jedoch, dass diese globalen Mittelwerte die tatsächliche Exposition der Zellaggregate gegenüber mechanischen Kräften (Scherstress und EDR) nicht korrekt abbilden, da diese Kräfte stark von der Trajektorie der Aggregate, deren Größe und Dichte sowie von lokalen Strömungsbedingungen abhängen. Dies führt zu Unsicherheiten bei der Übertragung von Protokollen auf größere Volumina.

2. Methodik

Die Studie kombiniert in silico-Simulationen (CFD) mit in vitro-Experimenten, um die Hydrodynamik in Vertical-Wheel-Bioreaktoren (VWBR) zu charakterisieren.

• CFD-Simulationen (In Silico):

  • Geometrie: Transiente, 3D-Turbulenzsimulationen für VWBRs mit 100 mL und 500 mL Volumen.
  • Strömungsmodell: Verwendung des Realizable k-ε-Turbulenzmodells mit einer freien Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (Level-Set-Methode).
  • Partikelverfolgung (Lagrange-Ansatz): Zellaggregate (Durchmesser 200–1.000 µm) wurden als sphärische Partikel modelliert. Ihre Trajektorien wurden unter Berücksichtigung von Widerstands-, Auftriebs-, Gravitations-, Druckgradient- und virtuellen Massenkräften berechnet.
  • Parameter: Simulationen bei fünf Rührergeschwindigkeiten (20–80 U/min).
  • Analyse: Entlang der Partikeltrajektorien wurden die historischen Expositionen gegenüber Scherstress und EDR erfasst und statistisch ausgewertet (Mediane, Verteilungen), anstatt nur Volumenmittelwerte zu betrachten.

• Zellkultur (In Vitro):

  • Zelllinie: Undifferenzierte ESI-017 hPSCs.
  • Protokoll: Kultur in 100 mL und 500 mL VWBRs über 6 Tage bei 30, 40 und 60 U/min.
  • Messgrößen: Aggregationsrate (Effizienz), tägliche und kumulative Zellvermehrung (Fold-Ratio), finale Zellzahl und Aggregatgröße.

3. Wichtige Beiträge

• Paradigmenwechsel bei der Skalierung: Die Arbeit schlägt vor, von rein Euler'schen Kennzahlen (Volumenmittelwerte) zu einer Lagrange-basierten Analyse überzugehen, die die gesamte Geschichte der mechanischen Exposition eines Zellaggregats entlang seiner Trajektorie berücksichtigt.
• Quantifizierung der Diskrepanz: Es wird gezeigt, dass die tatsächlich von den Aggregaten erfahrenen Scherstress- und EDR-Werte signifikant von den volumenmittelten (VA) und maximalen Werten des Fluids abweichen.
• Einflussfaktoren: Die Studie identifiziert, dass Aggregatgröße, Rührergeschwindigkeit und Bioreaktorgröße die Trajektorien und damit die mechanische Exposition maßgeblich beeinflussen. Größere Aggregate neigen dazu, aufgrund der Gravitation schneller nach unten zu sinken und verbringen mehr Zeit in Zonen mit hoher Dissipation (nahe dem Rührer).

4. Ergebnisse

• Strömungsfeld und Trajektorien:

  • Das Strömungsfeld weist zwei Zirkulationszonen auf: eine primäre Zone um das Rührrad und eine sekundäre Zone im oberen Bereich.
  • Größere Aggregate bewegen sich schneller und folgen weniger den Strömungslinien, da die Gravitationskräfte dominieren. Kleinere Aggregate bleiben länger in der oberen, weniger turbulenten Zone.
  • Bei gleicher Rührergeschwindigkeit erfahren Aggregate im 500 mL-Bioreaktor höhere Geschwindigkeiten und damit höhere mechanische Belastungen als im 100 mL-Bioreaktor, bedingt durch den größeren Radradius.

• Vergleich der Kennzahlen:

  • Die Lagrange-basierten Verteilungen von EDR und Scherstress sind stark rechtsschief und weichen deutlich von den Volumenmittelwerten ab.
  • Volumenmittelwerte sind schlechte Prädiktoren für die tatsächliche Zellbelastung. Ein Skalierungsansatz basierend auf gleichen Volumenmittel-EDR-Werten (z. B. 100 mL bei 40 U/min vs. 500 mL bei 30 U/min) führt zu unterschiedlichen biologischen Ergebnissen.

• Biologische Auswirkungen:

  • EDR vs. Scherstress: Die Energiedissipationsrate (EDR) hat einen signifikanten Einfluss auf die Aggregationsrate, die finale Zellzahl und die Aggregatgröße. Der Scherstress hat unter den getesteten Bedingungen einen geringeren, aber dennoch messbaren Einfluss.
  • Optimale Bedingungen: Eine Rührergeschwindigkeit von 40 U/min im 100 mL-Bioreaktor ergab die beste Balance aus hoher Zellzahl und geringer Varianz der Aggregatgröße.
  • Skalierungsergebnisse: Ein Versuch, das 100 mL-Protokoll (40 U/min) auf 500 mL zu skalieren, indem man den gleichen Volumenmittel-Scherstress beibehält (30 U/min), führte zu signifikant niedrigeren Zellzahlen und einer anderen Aggregatgrößenverteilung.
  • Kumulative Effekte: Während tägliche Wachstumsraten (Fold-Ratios) nur geringfügig variierten, zeigte sich über den gesamten Kultivierungszeitraum ein signifikanter kumulativer Effekt der EDR auf die Gesamtvermehrung.

5. Bedeutung und Schlussfolgerung

Die Studie demonstriert, dass traditionelle Skalierungsansätze für Vertical-Wheel-Bioreaktoren unzureichend sind, da sie die komplexe Wechselwirkung zwischen Partikelgröße, Dichte und Strömungsfeld ignorieren.

• Bessere Skalierungsgrundlage: Die Verwendung von Lagrange-basierten Expositionshistorien (Trajektorienanalyse) bietet eine überlegene Grundlage für die Skalierung von Bioreaktoren, da sie die tatsächliche mechanische Belastung der Zellen besser widerspiegelt.
• Dynamische Protokolle: Da sich die Aggregatgröße während der Kultur ändert, könnten dynamische Rührgeschwindigkeits-Protokolle (z. B. niedrigere Geschwindigkeit zu Beginn für die Aggregation, höhere Geschwindigkeit später für die Proliferation) notwendig sein, um eine optimale mechanische Umgebung zu gewährleisten.
• Klinische Relevanz: Diese Erkenntnisse sind entscheidend für die zuverlässige Herstellung großer Mengen an hPSCs für regenerative Therapien, da sie helfen, die Zellqualität und -ausbeute bei der Hochskalierung zu sichern.

Zusammenfassend zeigt das Paper, dass das Verständnis der Trajektorien-basierten Exposition gegenüber mechanischen Kräften (insbesondere EDR) der Schlüssel zur erfolgreichen Skalierung von Stammzellkulturen in Suspension ist.