Two-photon characterisation of long-Stokes-shift dye ATTO 490LS for single-laser multicolour imaging

Questo studio caratterizza le proprietà di eccitazione a due fotoni del fluoroforo ATTO 490LS, dimostrando la sua efficacia per l'imaging multicolore in vivo con un singolo laser a 920 nm.

L'essenziale

🌟 Il Problema: La "Luce Unica" che non basta

Immagina di voler guardare un'orchestra complessa (il cervello di una mosca) per capire come suonano i diversi strumenti. Per farlo, hai bisogno di due colori di luce: uno per vedere i violini (che brillano di verde) e uno per vedere i violoncelli (che brillano di rosso).

Il problema è che il tuo microscopio è come un vecchio proiettore cinematografico: ha solo una lampadina che emette un unico tipo di luce (in questo caso, una luce infrarossa invisibile a 920 nanometri).
Normalmente, per vedere due cose diverse, avresti bisogno di due lampadine diverse. Ma qui gli scienziati volevano usare una sola lampadina per accendere entrambi i colori contemporaneamente. È come se volessi far suonare un violino e un violoncello usando un solo tasto di un pianoforte. Sembra impossibile, vero?

💡 La Soluzione: L'Inganno della "Lunga Corsa" (Stokes Shift)

Qui entra in gioco la protagonista dello studio: un colorante speciale chiamato ATTO 490LS.

Immagina che questo colorante sia un atleta molto particolare:

1. L'Attesa: Quando la luce del tuo unico laser (la lampadina) lo colpisce, lui la assorbe come se fosse una palla da tennis lanciata con forza.
2. La Corsa: Invece di rimbalzare subito indietro (come fanno i coloranti normali), questo atleta corre per un lungo tratto, perdendo un po' di energia lungo la strada.
3. Il Tiro: Alla fine della sua corsa, lancia la palla indietro, ma ora la palla è diventata molto più grande e lenta.

In termini scientifici, questo si chiama "Long Stokes Shift" (spostamento di Stokes lungo). Significa che il colorante assorbe una luce di una certa lunghezza d'onda (il laser a 920 nm) ma, dopo aver "perso" un po' di energia, la riemette come una luce completamente diversa, molto più rossa e lontana.

🔬 Cosa hanno scoperto gli scienziati?

Gli autori hanno fatto tre cose fondamentali:

1. Hanno testato l'atleta: Hanno scoperto che questo colorante ATTO 490LS funziona benissimo con il loro laser a 920 nm. Anche se non è il punto di massima efficienza assoluta, è abbastanza potente da brillare.
2. Hanno creato la "doppia visione": Hanno preso un cervello di mosca e lo hanno colorato con due cose:
   • Una sostanza che brilla di verde (Alexa Fluor 488).
   • Il nostro nuovo colorante rosso (ATTO 490LS).
3. Il trucco della separazione: Quando hanno acceso il laser a 920 nm, è successo qualcosa di magico:
   • La sostanza verde ha brillato di verde.
   • Il colorante rosso ha brillato di rosso.
   • Il punto chiave: Poiché il colorante rosso ha fatto quella "lunga corsa" (lo spostamento di Stokes), la sua luce rossa è così lontana dalla luce verde che i due colori non si sono mescolati. È come se avessi due finestre separate: una lascia passare solo il verde, l'altra solo il rosso, anche se la luce che entra dalla porta è la stessa.

🧠 Perché è importante?

Prima di questo studio, se volevi vedere due cose diverse nel cervello di un animale vivente, ti serviva un microscopio costoso con due laser diversi. Questo rendeva l'esperimento difficile e costoso per molti laboratori.

Ora, grazie a questo "trucco" del colorante ATTO 490LS:

• Chiunque abbia un microscopio con un solo laser (anche i modelli più vecchi) può fare esperimenti complessi a due colori.
• Si può vedere la struttura del cervello (col rosso) e l'attività dei neuroni (col verde, usando sensori come il GCaMP) allo stesso tempo.

🎉 In sintesi

Gli scienziati hanno trovato un modo per ingannare la fisica: hanno usato un colorante che "dimentica" la luce che gli viene data e la restituisce di un colore completamente diverso. Questo permette di usare un'unica fonte di luce per accendere due colori diversi, rendendo la ricerca sul cervello molto più accessibile, economica e potente. È come se avessimo scoperto che un singolo tasto di pianoforte può suonare due note diverse, a patto che il tasto sia fatto del materiale giusto!

Sommario tecnico

Titolo: Caratterizzazione del colorante a lungo spostamento di Stokes (LSS) ATTO 490LS per l'imaging multifluorescente a singolo laser in microscopia a due fotoni.

1. Il Problema

L'imaging multifluorescente in vivo, in particolare nel cervello di Drosophila melanogaster, spesso richiede l'uso di più laser per eccitare diversi fluorofori con profili di eccitazione distinti. Tuttavia, molti sistemi di microscopia a due fotoni (2P), specialmente quelli di generazioni precedenti o configurati per l'uso standard, sono dotati di un singolo laser a lunghezza d'onda fissa (tipicamente 920 nm), ottimizzato per l'eccitazione di indicatori genetici verdi come il GCaMP (basato sulla GFP).
Esiste un bisogno critico di fluorofori rossi che possano essere eccitati efficientemente da questo stesso laser a 920 nm, ma che emettano a lunghezze d'onda molto diverse (rosso/lontano dal rosso) per evitare sovrapposizioni spettrali. I coloranti a lungo spostamento di Stokes (LSS) sono ideali per questo scopo, poiché presentano un'ampia differenza tra la lunghezza d'onda di eccitazione e quella di emissione. Sebbene l'ATTO 490LS mostri un eccellente spostamento di Stokes (165 nm) in condizioni di eccitazione a singolo fotone, le sue proprietà ottiche in regime di eccitazione a due fotoni non erano state precedentemente caratterizzate, limitandone l'uso in combinazione con sensori verdi su sistemi a laser singolo.

2. Metodologia

Gli autori hanno condotto una caratterizzazione spettroscopia completa dell'ATTO 490LS (coniugato con streptavidina) utilizzando cervelli di Drosophila ex vivo.

• Preparazione del Campione:
  • Utilizzo di linee transgeniche elav-Gal4 > UAS-TID-Dlg1. Il sistema TurboID (TID) è stato utilizzato per biotinilare le proteine vicine al marcatore sinaptico Dlg1.
  • I cervelli sono stati fissati e incubati con ATTO 490LS coniugato a streptavidina (che si lega alla biotina) e, in parallelo, con un anticorpo anti-c-Myc seguito da un secondario Alexa Fluor 488 per creare un campione doppio marcato.
• Scansioni Spettrali (Leica TCS SP8 DIVE):
  • Scansione di eccitazione: La lunghezza d'onda del laser è stata variata da 680 nm a 1200 nm (passi di 20 nm) mantenendo fissa la finestra di rilevamento dell'emissione (500-685 nm) per identificare i picchi di eccitazione a due fotoni.
  • Scansione di emissione: L'eccitazione è stata fissata a diverse lunghezze d'onda (780, 920, 940, 1040 nm) mentre la finestra di rilevamento dell'emissione è stata scansionata da 500 nm a 780 nm.
• Imaging a Due Fotoni (Microscopi Thorlabs):
  • I campioni sono stati immaginati utilizzando due diversi microscopi Thorlabs (A-SCOPE e B-SCOPE) equipaggiati con un laser a fibra fisso a 920 nm.
  • Il rilevamento è stato effettuato tramite due fotomoltiplicatori (PMT) distinti: uno con filtro verde (525/50 nm o 500-550 nm) per l'Alexa Fluor 488 e uno con filtro rosso (605/70 nm o 570-640 nm) per l'ATTO 490LS.
  • Sono stati testati diversi livelli di potenza del laser e guadagni dei rivelatori per ottimizzare il rapporto segnale/rumore e minimizzare la sovrapposizione dei canali.

3. Risultati Chiave

• Caratterizzazione Spettrale:
  • L'ATTO 490LS mostra tre picchi di eccitazione a due fotoni: a 780 nm (massima efficienza), 940 nm e 1040 nm.
  • Sebbene il picco massimo sia a 780 nm, l'eccitazione a 940 nm (vicino ai 920 nm disponibili commercialmente) genera un segnale significativo, circa 3-4 volte superiore al rumore di fondo (autofluorescenza).
  • L'emissione massima si verifica a 640 nm indipendentemente dalla lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata (780, 920, 940 o 1040 nm), confermando un ampio spostamento di Stokes anche in regime a due fotoni.
• Imaging Duplex (Singolo Laser):
  • È stato dimostrato con successo l'imaging simultaneo di ATTO 490LS (rosso) e Alexa Fluor 488 (verde) utilizzando un unico laser a 920 nm.
  • I segnali sono stati distinti chiaramente tramite filtri ottici e PMT separati:
    • L'Alexa Fluor 488 eccitato a 920 nm emette nel verde.
    • L'ATTO 490LS eccitato a 920 nm emette nel rosso (picco a 640 nm).
  • L'analisi delle strutture cerebrali (es. corpo ellissoide, lobi del corpo fungente) ha mostrato una marcatura specifica e non sovrapposta: alcune strutture erano marcate solo dal rosso, altre solo dal verde, e altre da entrambi, dimostrando la risoluzione spaziale e la specificità del metodo.
• Riduzione dell'Autofluorescenza: L'uso di lunghezze d'onda di eccitazione più lunghe (920 nm) rispetto a 780 nm ha ridotto significativamente l'autofluorescenza del tessuto, migliorando il contrasto.

4. Contributi Principali

1. Caratterizzazione Inedita: Questo studio fornisce la prima caratterizzazione delle proprietà ottiche a due fotoni dell'ATTO 490LS, colmando una lacuna nella letteratura scientifica.
2. Validazione per Sistemi a Laser Singolo: Dimostra che l'ATTO 490LS è un candidato ideale per l'imaging multicolore su microscopi a due fotoni dotati di un solo laser a 920 nm, una configurazione molto comune nei laboratori di neuroscienze.
3. Protocollo Sperimentale: Offre un protocollo dettagliato per l'uso combinato di coloranti LSS e anticorpi fluorescenti in cervelli di Drosophila, inclusi i passaggi di marcatura BioID/TurboID.
4. Strumento per l'Imaging Funzionale: Apre la strada all'uso di ATTO 490LS come marcatore strutturale stabile (o denominatore per sensori) in combinazione con sensori di calcio verdi (GCaMP) o altri indicatori funzionali, permettendo di correlare l'attività neurale con la morfologia senza bisogno di laser multipli.

5. Significato e Implicazioni

Questo lavoro ha un impatto significativo per la comunità delle neuroscienze, in particolare per gli studi su Drosophila:

• Accessibilità Tecnica: Rimuove la barriera tecnica e finanziaria associata all'acquisto di laser multipli o sistemi di sintonizzazione complessi per l'imaging multicolore. I laboratori con microscopi "legacy" (vecchi modelli) possono ora eseguire esperimenti duplex avanzati.
• Integrazione Funzionale-Strutturale: Permette di monitorare simultaneamente l'attività neurale (tramite sensori verdi come GCaMP) e la struttura o l'espressione proteica specifica (tramite ATTO 490LS) nello stesso animale, migliorando la capacità di decifrare la funzione dei circuiti neurali.
• Futuri Sviluppi: Gli autori propongono di coniugare l'ATTO 490LS a ligandi per tag come HaloTag e SNAP-tag, espandendo ulteriormente il toolkit per l'etichettatura chemogenetica in vivo.

In sintesi, l'articolo stabilisce l'ATTO 490LS come uno strumento robusto e versatile per l'imaging a due fotoni multicolore, rendendo possibile l'analisi complessa dei circuiti neurali con hardware semplificato.