An Instrument for Physical Vapor Deposition onto Cryo-EM Samples for Microsecond Time-Resolved Cryo-EM

본 논문은 레이저 플래시 용융을 위해 동결된 그리드 위에 화합물을 증착함으로써 마이크로초 시간 분해 실험을 가능하게 하는 cryo-EM 샘플용 물리 기상 증착 장치의 설계와 운영을 제시하며, 이는 밀봉 막 최적화 및 단백질 역학 개시에서 그 유용성을 입증한다.

핵심

고분자, 즉 우리 세포 내에서 모든 일을 수행하는 작은 기계의 고해상도 사진을 찍으려 한다고 상상해 보세요. 일반적으로 전자 현미경으로 이러한 사진을 찍기 위해 과학자들은 파리를 공중에서 순간적으로 급속 동결하듯 단백질을 즉시 얼려야 합니다. 이를 **크라이오 전자 현미경 (Cryo-EM)**이라고 합니다.

그러나 한 가지 문제가 있습니다. 일단 얼면 단백질은 고정되어 움직일 수 없으므로, 그 작동 방식을 볼 수 없습니다. 최근 과학자들은 얼어붙은 시료를 마이크로초 (마이크로초) 단위의 극히 짧은 순간 동안 "순간 용해"시킨 후 다시 즉시 얼리는 방법을 찾아냈습니다. 이를 통해 과학자들은 단백질이 운동 중인 순간을 포착할 수 있게 되었으며, 이는 점프 중인 무용수의 사진을 찍는 것과 같습니다.

하지만 함정이 있었습니다. 얼음을 녹이면 단백질이 물방울 속에 떠 있게 되는데, 그 물방울이 공기와 접촉하면 단백질이 표면에 달라붙어 자유롭게 회전하지 못해 모든 각도에서 관찰하기 어렵습니다. 또한, 단백질이 새로운 화학 물질 (예: 약물) 에 어떻게 반응하는지 연구하고 싶다면, 얼어붙은 시료 위에 화학 물질을 그냥 부을 수 없습니다. 그렇게 하면 혼합되지 않기 때문입니다.

해결책: 얼어붙은 시료를 위한 "진공 페인트 분사기"

이 논문은 이러한 문제들을 해결하기 위해 구축된 새로운 기계를 소개합니다. 이는 얼어붙은 현미경 슬라이드를 위해 특별히 설계된 첨단 진공 밀폐 분사실과 같습니다.

다음은 간단한 비유를 통해 작동 원리를 설명한 것입니다:

1. "샌드위치" 기법 (시료 밀봉)
얼어붙은 단백질을 섬세한 샌드위치라고 상상해 보세요. 보통 위와 아래는 공기에 노출되어 있습니다. 새로운 기계는 샌드위치가 여전히 얼어있는 상태에서 위와 아래에 "유리" (이산화규소) 의 극히 얇은 층을 분사할 수 있습니다.

• 왜 이렇게 할까요? 녹았을 때 물이 증발하지 않도록 내부 물을 밀봉하고, 단백질이 공기와 떨어지도록 하여 레이저가 얼음을 녹일 때 자유롭게 회전할 수 있게 합니다.
• 발견: 과학자들은 이 "유리"가 얼마나 얇을 수 있는지 테스트했습니다. 그 결과, 유리가 너무 얇으면 (원자 두 개 층 미만) 미세한 구멍이 생겨 물이 새어 나옵니다. 하지만 두 개 층보다 조금 더 두꺼우면 완벽하게 막아냅니다. 이것이 그들이 사용할 수 있는 가장 얇은 "밀봉" 층입니다.

2. "마법 가루" 기법 (화학 물질 혼합)
얼어붙은 케이크가 있고, 케이크를 녹이지 않고도 초콜릿 칩을 넣었을 때 어떤 일이 일어나는지 보고 싶다고 상상해 보세요.

• 옛날 방식: 얼어붙은 시료로는 이를 실제로 할 수 없었습니다.
• 새로운 방식: 이 기계는 칼슘 염과 같은 화학 물질의 미세한 가루를 얼어붙은 시료 위에 분사할 수 있습니다. 가루는 위에 놓인 채 기다립니다.
• 방아쇠: 과학자가 레이저 펄스로 시료를 때려 순간적으로 얼음을 녹이면, 얼음이 물로 변하고 "가루"가 즉시 녹아 단백질과 혼합됩니다.
• 증거: 과학자들은 붉은색으로 빛나는 특수 염료가 포함된 시료에 칼슘 가루를 분사하여 이를 테스트했습니다. 레이저가 얼음을 녹이자 칼슘이 염료와 혼합되어 빛이 어두워졌습니다. 이는 화학 물질이 눈 깜짝할 사이에 완벽하게 혼합되었음을 증명했습니다.

왜 이것이 중요한가
이 기계는 얼어붙은 생물학을 위한 만능 리모컨과 같습니다. 과학자들이 다음을 가능하게 합니다:

1. 보호: 시료가 증발하거나 달라붙지 않도록 보호합니다.
2. 성분 추가: 실험이 시작되기 전에 시료가 얼어있는 후에 약물이나 화학 물질과 같은 성분을 시료에 추가합니다.
3. 즉시 혼합: 레이저로 얼음을 녹여 반응을 원하는 순간에 정확히 촉발함으로써 모든 것을 즉시 혼합합니다.

저자들은 이 기계가 성분을 추가하고 시료를 순간 용해시키는 것을 반복하여 복잡한 다단계 실험을 구축할 수 있는 미래 실험을 위한 표준 "주방"이 될 수 있다고 제안합니다. 이 모든 과정은 시료를 기계에서 꺼내지 않고 이루어집니다.

요약하자면
이 논문은 과학자들이 보호용 유리나 화학 가루로 얼어붙은 시료를 "페인트칠"할 수 있게 해주는 도구를 소개합니다. 레이저로 시료를 찌르면 얼음이 녹고 페인트는 액체로 변하며 화학 물질은 즉시 혼합됩니다. 이를 통해 과학자들은 단백질의 이동과 반응을 실시간으로 관찰할 수 있게 되며, 얼어붙은 시료에 성분을 순간적으로 혼합하는 방법이라는 문제를 해결합니다.

기술 요약

기술 요약: 마이크로초 시간 분해 극저온 전자 현미경 (Cryo-EM) 을 위한 극저온 시료에 대한 물리적 기상 증착용 장치

문제 및 배경
레이저 플래시 용융을 기반으로 한 마이크로초 시간 분해 극저온 전자 현미경 (Cryo-EM) 은 최근 마이크로초 시간 규모에서 단백질 운동을 관찰할 수 있게 해주었습니다. 이 기술은 동역학을 시작하기 위해 레이저 펄스로 동결된 시료를 briefly 녹인 후, 과도한 구성을 포획하기 위해 급속하게 재비트리화 (revitrification) 하는 과정을 포함합니다. 이 접근법은 Cryo-EM 의 시간 분해능을 확장시켰을 뿐만 아니라, 시료 준비에 대한 새로운 기회를 제시하기도 했습니다. 구체적으로, 플래시 용융 전에 동결된 시료 위에 화합물을 증착시키는 능력은 시료 환경을 동적으로 변경할 수 있는 방법을 제공합니다. 이전 연구는 비정질 얼음이나 이산화 규소 막을 증착하여 입자를 공기 - 물 계면으로부터 분리시킴으로써 선호되는 입자 배향을 완화할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 진공 환경 내에서 비휘발성 화합물을 Cryo-EM 시료에 직접 물리적 기상 증착 (PVD) 하기 위한 전용 장치가 부재하여, 이러한 실험을 위해 시약 도입이나 초박막 액체 셀 기하구조 생성 능력이 제한되었습니다.

방법론
저자들은 Cryo-EM 시료에 대한 물리적 기상 증착을 위해 설계된 맞춤형 진공 장치의 설계와 운영을 설명합니다. 이 장치는 $3 \times 10^{-8}$mbar 까지 배기된 6-way 스테인리스강 진공 챔버를 특징으로 합니다. Cryo-EM 시료는 JEOL 2010 투과 전자 현미경의 개조된 로드락 (load-lock) 을 통해 모터 회전 스테이지에 통합되어 로드됩니다. 이 설정을 통해 시료 홀더를 회전시켜 시료의 한쪽 또는 양쪽 면에 증착을 수행할 수 있습니다.

이 시스템은 두 가지 증착 모드를 지원합니다:

1. 가스 도징 (Gas Dosing): 휘발성 화합물을 가스 도징 밸브를 통해 도입하여 시료의 양쪽 면에 동시에 증착을 가능하게 합니다.
2. 전자 빔 증발 (Electron Beam Evaporation): 낮은 증기압 화합물을 전자 빔 증발기를 사용하여 증착합니다. 시스템은 저항 가열 텅스텐 코일에서 생성된 전자 빔으로 가열되는 흑연 라이너가 있는 탄탈륨 도가니를 활용합니다. 분출 빔 (effusive beam) 은 1mm 개구를 통해 형성됩니다.

정밀한 제어를 보장하기 위해, 증착 속도는 분출 빔의 일부를 이온화하여 생성된 이온 전류를 기반으로 하는 피드백 루프를 사용하여 능동적으로 안정화됩니다. 이 신호는 석영 결정 마이크로밸런스 (QCM) 에 대해 보정됩니다. 저자들은 QCM 판독값이 복사 가열로 인해 실제 속도보다 약 40% 높지만, 이온 전류와 증착 속도 간의 선형 관계가 원하는 속도를 빠르게 설정할 수 있게 해준다고 지적합니다. 시료는 비비트리화 (devitrification) 를 방지하기 위해 전체 과정에서 극저온 (~100 K) 으로 유지됩니다.

주요 기여 및 결과
이 논문은 두 가지 주요 실증을 통해 장치에 대한 상세한 특성을 제공합니다:

1. 최소 막 두께 결정: 저자들은 이 장치를 사용하여 Cryo-EM 시료에 이산화 규소 ($SiO_2$) 막을 증착하여 초박막 액체 셀을 생성했습니다. 플래시 용융 및 재비트리화 과정에서 파손 없이 견딜 수 있는 이러한 막에 필요한 최소 두께를 조사했습니다.

   • 약 0.75 nm(약 2 단층) 의 막은 30 µs 레이저 펄스 후 시료를 밀봉하여 증발을 방지하고 균일한 얇은 액체 막을 유지하는 데 성공했습니다.
   • 약 0.5 nm(2 단층 미만) 으로 줄어든 막은 실패하여 기공을 통한 시료 증발을 나타내는 대비 변이를 나타냈습니다.
   • 이는 이 기하구조에서 밀봉 막을 위한 최소 기능적 두께가 단층 두 개를 약간 초과함을 확립합니다.

2. 마이크로초 혼합 실험: 저자들은 시료에 시약을 증착함으로써 단백질 동역학을 시작할 수 있음을 입증했습니다.

   • 칼슘 감지 염료인 Fura Red 가 포함된 Cryo-EM 시료가 준비되었습니다.
   • 무수 염화 칼슘 ($CaCl_2$) 의 0.5 nm 층이 시료의 한쪽 면에 기상 증착되었습니다.
   • 50 µs 레이저 펄스로 플래시 용융 시, 칼슘 이온이 시료와 혼합되었습니다.
   • 형광 현미경은 재비트리화 영역에서 Fura Red 의 형광 강도가 감소하여 칼슘 이온이 염료에 결합했음을 확인했습니다. 증착된 $CaCl_2$ 가 없는 대조 실험에서는 그러한 대비 변화가 관찰되지 않았습니다.

의의 및 주장
저자들은 이 장치가 마이크로초 시간 분해 Cryo-EM 을 위한 통합 플랫폼의 기초를 형성한다고 주장합니다. 동결된 시료에 화합물의 물리적 기상 증착을 가능하게 함으로써, 이 시스템은 다음을 허용합니다:

• 얇은 막을 안정화시키고 관찰 창을 수십 마이크로초에서 수백 마이크로초로 확장하는 초박막 액체 셀의 생성.
• 광케이지 화합물의 필요성을 우회하여 플래시 용융 시 시료와 빠르게 혼합되는 시약 (소분자 또는 리간드 등) 을 증착함으로써 단백질 동역학을 시작하는 새로운 전략.
• 펩타이드나 단백질과 같은 더 크고 비휘발성 생체 분자를 증착하기 위해 소프트 랜딩 질량 분석법 접근법과의 미래 통합 가능성.

이 논문은 이 통합 접근법이 이동을 최소화하여 시료 오염을 줄이고, 증착과 레이저 재비트리화를 번갈아 수행하는 복잡한 실험 순서를 가능하게 함으로써 접근 가능한 단백질 동역학의 범위를 확장한다고 결론지었습니다.