A Fragment Screen Identifies Acrylamide Covalent Inhibitors of the TEAD/YAP Protein-Protein Interaction

이 논문은 TEAD-YAP 단백질 간 상호작용을 조절하는 히포 경로의 핵심 표적인 TEAD 단백질의 팔미테이트 포켓에 있는 보존된 시스테인과 공유결합을 형성하여 TEAD-YAP 결합을 억제하는 아크릴아미드 기반 분자 단편을 발견하고, 이를 통해 알로스테릭 공유결합 억제제 개발의 가능성을 제시했습니다.

핵심

1. 배경: 나쁜 친구들의 악수 (TEAD 와 YAP)

우리 몸에는 TEAD와 YAP라는 두 가지 단백질이 있습니다. 정상적인 상태에서는 이 둘이 따로 놀지만, 암이 생기면 이 둘이 아주 단단하게 손을 잡고 (결합해서) "우리 힘을 합쳐서 암 세포를 키우자!"라고 외치며 기하급수적으로 증식하게 만듭니다.

• 문제점: 이 두 친구가 손을 잡는 부분은 너무 평평하고 넓어서, 약이 끼어들 틈이 전혀 없습니다. 마치 두 사람이 꽉 껴안고 있는데 그 사이로 약을 넣으려다 보니, 약이 끼어들 공간이 없는 것과 같습니다. 그래서 과학자들은 오랫동안 "이 결합을 막을 약은 만들 수 없다"고 생각했습니다.

2. 해결책: 숨겨진 '비밀 통로' 발견

하지만 과학자들은 TEAD라는 친구의 옷장 깊숙한 곳에 **비밀 통로 (팔미테이트 주머니)**가 있다는 것을 발견했습니다.

• 이 통로는 YAP 와 손을 잡는 곳과는 완전히 다른 곳에 있습니다.
• 이 통로 안에는 **TEAD 의 '비밀 열쇠구멍' (시스테인이라는 아미노산)**이 하나 숨어 있습니다.

비유하자면:
두 친구가 악수하는 손 (결합 부위) 을 직접 떼어내려니 너무 힘들지만, TEAD 가 입은 옷의 주머니 (비밀 통로) 에 있는 열쇠구멍에 **특수한 접착제 (약물)**를 바르면, TEAD 가 옷을 입고 있는 것만으로도 몸이 뒤틀려서 YAP 와 손을 잡을 수 없게 된다는 것입니다.

3. 실험: 작은 조각 (프래그먼트) 으로 시작하다

과학자들은 이 비밀 통로에 딱 맞는 약을 만들기 위해, 먼저 **수백 개의 아주 작은 조각 (프래그먼트)**들을 준비했습니다. 이 조각들은 마치 레고 블록처럼 아주 작고 단순한 형태입니다.

• 실험 과정: 이 작은 레고 조각들을 TEAD 의 비밀 통로에 넣어보았습니다.
• 결과: 그중에서 **1 번 조각 (ACR-021)**이 통로 깊숙이 들어가서 TEAD 의 열쇠구멍에 딱 붙는 것을 발견했습니다. 그리고 이 조각이 붙자 TEAD 는 YAP 와 손을 잡지 못하게 되었습니다!

4. 발전: 작은 조각을 튼튼한 열쇠로 다듬기

1 번 조각은 효과가 있었지만, 아직 약했습니다. 과학자들은 이 조각을 더 튼튼하고 강력하게 만들기 위해 4 가지의 새로운 버전을 만들었습니다.

• 마치 낚시바늘에 미끼를 더 잘 붙이거나, 바늘 끝을 더 날카롭게 다듬는 과정과 같습니다.
• 그중 **14 번 (ACR-374)**이라는 버전이 가장 강력했습니다. 이 약은 TEAD 의 열쇠구멍에 반응해서 영구적으로 딱 붙어버리는 (공유 결합) 성질이 있어, 한 번 붙으면 절대 떨어지지 않습니다.

5. 놀라운 발견: 약이 붙는 방식이 다릅니다!

과학자들은 이 약이 TEAD 의 4 가지 버전 (TEAD 1, 2, 3, 4) 에 어떻게 붙는지 X 선 촬영 (결정 구조 분석) 으로 자세히 보았습니다. 여기서 아주 흥미로운 일이 일어났습니다.

• TEAD 2 에서는: 약이 통로의 중간에 걸려 있습니다.
• TEAD 3 에서는: 약이 통로의 가장 깊은 끝까지 밀고 들어가서, 원래 TEAD 가 기름 (팔미테이트) 을 넣는 자리와 똑같은 모양을 하고 있습니다.

왜 중요한가요?
약이 **중간에 걸릴 때 (TEAD 2)**는 TEAD 의 몸이 비틀려서 YAP 와 손을 잡지 못하게 됩니다. 하지만 **깊숙이 들어갈 때 (TEAD 3)**는 오히려 TEAD 가 YAP 와 더 잘 손을 잡을 수 있게 도와줄 수도 있습니다.
즉, 같은 약이라도 TEAD 의 종류에 따라 붙는 위치가 달라서, 약효가 완전히 다르게 나타나는 것입니다.

6. 결론: 암 치료의 새로운 희망

이 연구는 다음과 같은 의미를 가집니다.

1. 새로운 전략: TEAD 와 YAP 가 손을 잡는 직접적인 장면을 막을 수 없다면, TEAD 의 **비밀 통로 (주머니)**를 공격해서 간접적으로 떼어놓는 전략이 유효함을 증명했습니다.
2. 정밀 타격: 약이 TEAD 의 어떤 아미노산에 붙느냐에 따라 효과가 달라진다는 것을 구조적으로 밝혀냈습니다. 이는 앞으로 더 강력한 약을 만들 때, 약이 정확히 어디에 닿아야 하는지 설계도를 제공해 줍니다.
3. 미래: 이 작은 조각들이 암 세포의 성장을 막는 강력한 약으로 발전할 수 있는 초석이 되었습니다.

한 줄 요약:

"암을 부추기는 두 단백질이 손을 잡는 것을 막을 수 없다면, 한쪽 단백질의 숨겨진 주머니에 접착제를 붙여서 몸이 뒤틀리게 만들어, 자연스럽게 손을 떼게 만들자!"

이 연구는 그 '접착제'를 찾는 첫걸음을 성공적으로 내디딘 것입니다.

기술 요약

1. 연구 배경 및 문제 제기 (Problem)

• Hippo 경로와 암: TEAD 전사 인자는 YAP/TAZ 와 결합하여 세포 증식, 생존, 암 전이와 관련된 유전자 (CTGF, CYR61, MYC 등) 의 발현을 조절합니다. 암세포에서는 Hippo 경로가 비활성화되어 YAP/TAZ 가 핵으로 이동하여 TEAD 와 결합함으로써 종양 성장이 촉진됩니다.
• 약물 개발의 난제: TEAD 와 YAP 의 결합 인터페이스는 면적이 넓고 (1000 Ų 이상) 명확한 결합 주머니 (pocket) 가 없어 '약물 개발이 불가능한 (undruggable)' 것으로 간주되어 왔습니다.
• 기존 전략의 한계: TEAD 는 팔미테이트 (palmitate) 결합 주머니를 가지고 있으며, 이곳에 공유결합성 억제제를 결합시켜 알로스테릭 (allosteric) 방식으로 YAP 결합을 방해하는 전략이 시도되었습니다. 그러나 기존 아크릴아미드 계열의 공유결합성 억제제들은 TEAD•YAP 상호작용을 효과적으로 억제하지 못하거나, 선택성 및 반응성 측면에서 한계가 있었습니다.

2. 연구 방법론 (Methodology)

• 분해자 스크리닝 (Fragment Screen): 372 개의 아크릴아미드 전기친화성 분해자 (electrophile fragments) 라이브러리를 TEAD4 와 YAP 결합에 대한 형광 편광 (Fluorescence Polarization, FP) 어세이를 통해 스크리닝했습니다.
• 공유결합성 확인:
  • 돌연변이 분석: 핵심 시스테인 (C367) 이 세린 (S) 으로 변이된 TEAD4C367S 와 비교하여 억제 효과가 사라지는지 확인했습니다.
  • 질량 분석 (Mass Spectrometry): 전체 단백질 질량 분석을 통해 분해자가 TEAD 의 팔미테이트 주머니 내 시스테인과 공유결합 (adduct) 을 형성했는지 확인했습니다.
• 구조 - 활성 관계 (SAR) 연구: 히트 (Hit) 화합물인 **1 (ACR-021)**을 기반으로 4 가지 유도체 (14-17) 를 합성하여 구조적 변형이 억제 활성에 미치는 영향을 분석했습니다.
• 동역학 및 열역학 분석: 시간 및 농도 의존적 실험을 통해 이차 반응 속도 상수 ($k_{inact}/K_I$), 결합 상수 ($K_I$), 반응 반감기 ($t_{1/2}^\infty$) 를 계산했습니다.
• X-선 결정학 (Crystallography): TEAD2 및 TEAD3 와 억제제 복합체의 공결정 구조를 규명하여 결합 모드 (binding mode) 를 시각화했습니다.
• 알로스테릭 기전 검증: 팔미테이트 주머니 내 특정 아미노산 (Phe-393, Phe-415) 을 알라닌으로 변이시켜 억제제 활성 변화를 관찰하여 알로스테릭 억제 기전을 입증했습니다.

3. 주요 결과 (Key Results)

A. 히트 화합물 발굴 및 특성

• 1 (ACR-021) 과 2 (ACR-362): 372 개 분해자 중 TEAD4•YAP 결합을 억제하는 13 개 히트 중, **1 (ACR-021)**과 **2 (ACR-362)**만이 TEAD4 의 팔미테이트 주머니 내 보존된 시스테인 (C367) 과 공유결합을 형성하여 억제 효과를 보였습니다.
• 비가역적 억제: 1 (ACR-021) 은 TEAD4 와의 공유결합을 통해 YAP 결합을 비가역적으로 억제하며, C367S 돌연변이에서는 억제 효과가 사라졌습니다.
• 질량 분석: 1 (ACR-021) 은 TEAD4 에 284 Da 의 질량 증가 (분자량 일치) 를 유발하는 공유결합을 형성함을 확인했습니다.

B. 유도체 개발 및 효능 향상

• 14 (ACR-374) 의 개발: 1 (ACR-021) 의 아크릴아미드 전쟁머 (warhead) 를 경직화하고, 트리플루오로메틸기를 다양한 위치로 이동시킨 유도체를 합성했습니다.
• 효능 개선: **14 (ACR-374)**는 TEAD4 에 대해 $IC_{50}$ 2.9 µM 의 억제력을 보였으며, 반응 속도 ($k_{inact}$) 와 결합 친화도 ($K_I$) 를 종합한 $k_{inact}/K_I$ 값이 TEAD1 과 TEAD3 에서 특히 높았습니다 (TEAD3: 128 $M^{-1}s^{-1}$).
• 선택성: 14 (ACR-374) 는 TEAD1 과 TEAD3 에 대해 높은 반응성을 보였으나, TEAD2 와 TEAD4 에 대해서는 상대적으로 낮은 반응성을 보였습니다.

C. 결정 구조 및 결합 모드 (Structural Insights)

• TEAD2 와의 결합: 14 (ACR-374) 는 TEAD2 의 팔미테이트 주머니 내 Cys-380과 공유결합을 형성합니다. 흥미롭게도, 비대칭 단위 (asymmetric unit) 내 두 개의 모노머 (A 와 B) 에서 결합 시스테인이 달랐습니다 (모노머 A: Cys-380, 모노머 B: Cys-343). 이는 분자가 주머니 내에서 유연하게 배치될 수 있음을 시사합니다.
• TEAD3 와의 결합: TEAD3 에서는 14 (ACR-374) 가 Cys-368과 결합하며, 천연 팔미테이트의 결합 모드를 거의 완벽하게 모방 (mimic) 합니다.
• 결합 모드 차이와 효능: TEAD2 와 TEAD3 의 주머니 내 아미노산 (Leu-383 vs Met-371, Phe-233 vs Tyr-230) 의 미세한 차이가 분자의 결합 방향을 결정하며, 이는 TEAD3 에서 훨씬 빠른 반응 속도 ($k_{inact}/K_I$) 로 이어졌습니다.

D. 알로스테릭 억제 기전

• 돌연변이 실험: TEAD4 의 팔미테이트 주머니 내 Phe-393 과 Phe-415 를 알라닌으로 변이시켰을 때, 억제제 (14 와 TED-642) 의 억제력이 오히려 증가했습니다.
• 기전 규명: 이는 억제제가 주머니 내 특정 아미노산과 상호작용함으로써 TEAD 의 구조적 변화를 유도하고, 이것이 TEAD•YAP 인터페이스에 전달되어 결합을 약화시키는 알로스테릭 억제임을 강력히 시사합니다.

4. 주요 기여 및 의의 (Significance)

1. 새로운 억제제 스캐폴드 발견: TEAD•YAP PPI 를 표적으로 하는 아크릴아미드 공유결합성 분해자 (fragment) 를 최초로 발굴하여, 이 분야의 약물 개발을 위한 새로운 출발점을 제공했습니다.
2. 구조 기반 최적화: TEAD2 와 TEAD3 의 결정 구조를 통해 분자가 팔미테이트 주머니 내에서 어떻게 결합하는지, 그리고 아미노산의 미세한 차이가 결합 모드와 효능에 어떤 영향을 미치는지 규명했습니다.
3. 알로스테릭 억제 메커니즘 입증: 공유결합성 억제제가 팔미테이트 주머니에 결합하여 TEAD 의 구조적 변화를 유도하고, 이것이 YAP 결합 인터페이스에 영향을 미친다는 알로스테릭 기전을 실험적으로 증명했습니다.
4. 약물 개발 전략 제안: 높은 친화도 (high affinity) 보다는 빠른 반응 속도 ($k_{inact}$) 와 특이적인 주머니 내 아미노산 상호작용을 통해 알로스테릭 억제를 유도하는 것이 공유결합성 억제제 개발에 더 유리할 수 있음을 제시했습니다.

결론

이 연구는 TEAD•YAP 상호작용을 차단하는 새로운 공유결합성 아크릴아미드 억제제 (14, ACR-374 등) 를 발굴하고, 이들의 결합 모드와 알로스테릭 억제 기전을 구조 생물학적, 생화학적 방법으로 상세히 규명했습니다. 이는 난치성 암 치료제를 위한 TEAD 표적 약물 개발에 중요한 기초 데이터를 제공합니다.