Selective suppression and biasing of chemokine receptors CCR9 and ACKR4 through targeting CCL25 with de novo miniproteins

该研究利用 BindCraft 平台从头设计针对 CCL25 的微型蛋白，成功实现了对 CCR9 和 ACKR4 受体的选择性抑制与信号偏向性调控，为炎症性肠病的治疗及化学趋化因子受体激活机制的研究提供了新工具。

要点

这篇论文讲述了一个非常酷的故事：科学家利用人工智能（AI），设计出了微小的“人造蛋白质”，像特制的钥匙扣或路障一样，精准地拦截了体内一种叫"CCL25"的化学信使，从而阻止了免疫细胞乱跑，甚至能巧妙地改变它们的“行为模式”。

为了让你更容易理解，我们可以把身体里的免疫系统想象成一个繁忙的城市交通系统。

1. 背景：混乱的交通与失控的警察

• CCL25（化学信使）： 想象它是一个手持扩音器的交通指挥员。它在身体里大喊：“嘿，免疫细胞（警察），快来这里集合！”
• CCR9 和 ACKR4（受体）： 它们是接收信号的哨所。当指挥员喊话时，哨所就会指挥警察（免疫细胞）向特定方向移动。
• 问题所在： 在炎症性肠病（如克罗恩病）或癌症转移中，这个指挥员（CCL25）喊得太凶了，或者哨所太敏感，导致大量警察疯狂涌向肠道，造成炎症和破坏。
• 过去的难题： 以前科学家想给哨所（受体）装“锁”（药物），让它们听不见指挥员。但这很难，因为哨所结构复杂，锁很难配，而且容易把正常的交通也堵死。

2. 新策略：AI 设计的“特制路障”

这次，科学家换了一个思路：既然哨所难锁，那就直接抓住那个喊话的指挥员（CCL25）！

• AI 登场（BindCraft）： 科学家使用了一种叫"BindCraft"的 AI 工具。这就像是一个超级 3D 打印设计师。它不需要人类告诉它怎么设计，而是看着指挥员（CCL25）的照片，自动计算出成千上万个微小的“路障”（我们叫它Miniproteins，迷你蛋白），这些路障能完美地贴在指挥员身上，让他发不出声音，或者让他的声音变调。

3. 实验结果：四种不同的“路障”

科学家从 AI 设计的成千上万个方案中，挑出了 4 个最棒的“路障”（命名为 VUP25101, VUP25107, VUP25111, VUP25112），并发现它们有不同的绝招：

A. 普通路障组（VUP25101, 107, 112）：彻底封喉

• 原理： 这三个路障直接贴在指挥员（CCL25）的嘴巴上（也就是它和哨所接触的关键部位，叫 CRS1）。
• 效果： 指挥员被堵住嘴，完全发不出声音。哨所听不到任何指令，警察（免疫细胞）就完全停止移动。
• 比喻： 就像给交通指挥员戴上了强力口塞。不管他怎么想指挥，警察都动不了。这能有效治疗炎症，因为炎症细胞不会乱跑了。

B. 特殊路障组（VUP25111）：只拦一半的“偏科”路障

• 原理： 这个路障很特别，它没有堵住指挥员的嘴，而是贴在了指挥员的肩膀上（β1 链区域）。
• 神奇效果：
  1. 对 CCR9 哨所（主要哨所）： 指挥员虽然还能喊话，但声音变了调。警察（免疫细胞）还能收到“移动”的指令（G 蛋白信号），但不会收到“停止”或“撤退”的指令（Arrestin 信号被阻断）。
  2. 对 ACKR4 哨所（清道夫哨所）： 这个路障完全不影响它。清道夫哨所依然能正常工作，把多余的指挥员清理掉。
• 比喻： 想象这个路障给指挥员戴了一个变声器。
  • 它让指挥员对“主哨所”喊出的指令变得单一：只喊“前进”，不喊“停止”。
  • 同时，它不干扰“清道夫哨所”，让清道夫继续清理多余的指挥员，防止指挥员在血液里堆积过多导致新的混乱。
• 意义： 这是一个巨大的突破！以前我们只能让细胞“全停”或“全动”，现在我们可以微调它们的行为，只保留必要的功能，去掉有害的功能。

4. 为什么这很重要？

• 精准打击： 以前治疗炎症性肠病，药物往往像“地毯式轰炸”，副作用大。现在这种“路障”像精确制导导弹，只针对特定的化学信使。
• 解决难题： 很多针对受体的药物都失败了，但针对信使（指挥员）的设计却成功了。
• 新工具： 这些 AI 设计的迷你蛋白不仅是药物候选，还是科学家研究细胞如何“听指挥”的显微镜。比如，VUP25111 的发现告诉我们，原来指挥员的声音可以“偏科”，只让细胞做一部分反应。

总结

这就好比科学家利用 AI 设计出了特制的“魔法贴纸”。

• 有的贴纸贴在指挥员的嘴上，让他彻底闭嘴，交通彻底瘫痪（治疗炎症）。
• 有的贴纸贴在指挥员的肩膀上，让他只喊“前进”不喊“撤退”，或者只让特定的哨所听到（实现精准调控）。

这项研究证明了，利用 AI 从头设计蛋白质，可以像搭积木一样，创造出自然界不存在的“超级工具”，来解决那些传统药物解决不了的免疫疾病难题。

技术摘要

这是一份关于利用从头设计（de novo）迷你蛋白靶向趋化因子 CCL25 以调节其受体 CCR9 和 ACKR4 信号通路的详细技术总结。

1. 研究背景与问题 (Problem)

• 趋化因子系统的复杂性： 趋化因子及其受体（GPCR 亚家族）在免疫反应协调和细胞迁移中起关键作用。其失调会导致炎症性肠病（IBD）、克罗恩病及癌症转移。
• 药物开发的困境： 尽管 CCR9 是治疗肠道炎症和癌症转移的潜在靶点，但直接靶向受体的传统小分子拮抗剂在临床试验中屡屡失败，疗效不佳。
• 天然调节机制的启示： 自然界中（如蜱虫的 evasins 蛋白）存在通过直接结合趋化因子（配体）而非受体来调节免疫反应的机制。然而，由于趋化因子表面缺乏传统的小分子结合口袋（ligandability 低），开发针对趋化因子的高效调节剂极具挑战性。
• 核心问题： 如何利用新兴的 AI 驱动蛋白质设计技术，生成能够高亲和力结合 CCL25 并特异性阻断或偏倚其下游信号（如 CCR9 与 ACKR4 的激活）的迷你蛋白？

2. 方法论 (Methodology)

• 计算设计平台 (BindCraft)：
  • 研究团队使用了 BindCraft 平台，这是一个基于 AlphaFold2-Multimer 的逆向设计流程。
  • 输入目标： 使用 AlphaFold 数据库中的 CCL25 结构。为了聚焦核心结构域，使用了截短版 CCL25 (CCL25_ΔCT, 1-77)，该截短体保留了与全长蛋白相似的受体激活能力。
  • 设计策略： 未预设特定的结合热点，允许算法探索 CCL25 的整个表面。生成了 75-125 个氨基酸长度的迷你蛋白库。
  • 筛选与优化： 基于 ipTM（界面预测 TM 分数）、ipAE 和 pLDDT 等指标筛选候选者。对前 20 名设计进行了 100 纳秒的分子动力学（MD）模拟以评估稳定性，并计算结合自由能（MM/GBSA）。
• 实验验证体系：
  • 蛋白表达与纯化： 将筛选出的 4 种候选迷你蛋白（命名为 VUP25101, VUP25107, VUP25111, VUP25112）在大肠杆菌中表达并纯化。
  • 结合亲和力测定： 使用荧光偏振（Fluorescence Polarization, FP）技术测定迷你蛋白与荧光标记的 CCL25 的结合亲和力（Kd）。
  • 受体结合抑制： 使用 TR-FRET 技术检测迷你蛋白-CCL25 复合物对 CCL25 与受体（CCR9 和 ACKR4）结合的干扰情况。
  • 信号通路分析： 利用 BRET（生物发光共振能量转移）技术检测下游效应：
    • β-arrrestin2 招募（反映受体激活及内化）。
    • mini-Gi 蛋白招募（反映 G 蛋白偶联）。
    • cAMP 水平（反映 G 蛋白信号输出）。
    • GRK3 招募（反映激酶磷酸化）。
    • 受体内化（Internalization）。
  • 细胞迁移实验： 使用表达 CCR9 的 MOLT-4 淋巴细胞进行 Transwell 迁移实验，评估对细胞迁移的抑制效果。
  • 结构建模： 使用 AlphaFold3 预测受体 - 配体复合物及迷你蛋白 - 配体复合物的结构，分析空间位阻。

3. 主要发现与结果 (Key Results)

• 高亲和力结合： 所有 4 种设计的迷你蛋白均能高亲和力地结合全长 CCL25（pKd 值在 6.30 - 6.82 之间），尽管设计时使用的是截短模型。
• 两类不同的作用机制：
  1. 全面阻断型 (VUP25101, VUP25107, VUP25112)：
     • 结合模式： 预测结合在 CCL25 的 C 端螺旋区域，直接阻断受体 N 端与配体的相互作用（即阻断 CRS1 位点）。
     • 功能效应： 完全抑制 CCL25 与 CCR9 和 ACKR4 的结合。
     • 信号抑制： 彻底阻断 CCR9 和 ACKR4 的 β-arrestin 招募、G 蛋白激活、cAMP 抑制以及受体内化。
     • 细胞迁移： 显著抑制 MOLT-4 细胞的迁移。
  2. 信号偏倚型 (VUP25111)：
     • 结合模式： 结合在 CCL25 的 β1 链和 40s-loop 区域，未完全阻断 CRS1 或 CRS2 位点。
     • 受体选择性： 抑制 CCR9 的 arrestin 招募，但不抑制 ACKR4 的激活（结构模型显示其与 ACKR4 的 ECL2 无冲突，而与 CCR9 的 ECL2 存在轻微冲突）。
     • 信号偏倚 (Biased Signaling)： 这是一个关键发现。VUP25111 与 CCL25 形成的复合物在结合 CCR9 时，完全抑制了 arrestin 招募和受体内化，但保留了 G 蛋白信号（mini-Gi 招募和 cAMP 抑制）的完整性。
     • 细胞迁移： 由于 MOLT-4 细胞迁移主要依赖 G 蛋白信号，VUP25111 未能抑制细胞迁移，这与它保留 G 蛋白信号的结果一致。
• 结构机制解释： AlphaFold3 建模显示，VUP25111 与 CCL25 结合后，复合物在结合 CCR9 时会与受体的胞外环 2 (ECL2) 发生空间位阻。这种构象改变似乎允许 G 蛋白偶联，但破坏了 arrestin 结合所需的构象状态。

4. 关键贡献 (Key Contributions)

1. 验证了靶向配体的可行性： 证明了利用 AI 驱动的从头蛋白质设计（de novo design）可以成功生成针对“难成药”趋化因子（CCL25）的高亲和力迷你蛋白，且无需针对受体本身进行药物开发。
2. 揭示了 CRS1 阻断的充分性： 证实了仅阻断受体 N 端与配体的相互作用（CRS1 位点）就足以完全抑制受体激活，无需干扰跨膜结构域的结合。
3. 实现了配体诱导的信号偏倚： 首次报道了通过设计结合配体的迷你蛋白，将天然平衡激动剂（CCL25）转化为G 蛋白偏向性激动剂（针对 CCR9）。这种配体 - 受体复合物能激活 G 蛋白信号但阻断 arrestin 介导的内化和下游信号。
4. 提供了受体选择性工具： 展示了通过微调结合位点，可以实现对同一配体调控的不同受体（CCR9 vs ACKR4）的选择性抑制，这对于避免破坏天然清除机制（如 ACKR4 的清除作用）至关重要。

5. 意义与展望 (Significance)

• 治疗潜力： 针对 CCL25 的迷你蛋白为治疗炎症性肠病（IBD）和癌症转移提供了新的治疗策略。特别是能够区分受体亚型或诱导信号偏倚的分子，可能比传统拮抗剂具有更好的疗效和安全性。
• 药物发现新范式： 该研究展示了 AI 驱动的蛋白质设计在解决传统小分子药物难以靶向的蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）方面的巨大潜力。
• 机制解析工具： 这些迷你蛋白作为独特的研究工具，帮助解析了趋化因子受体激活的精细结构基础，特别是揭示了 CRS1 相互作用在稳定复合物中的关键作用，以及 ECL2 在信号偏倚中的潜在角色。
• 避免副作用： 通过保留 ACKR4 对 CCL25 的清除作用（VUP25111 不抑制 ACKR4），可以避免因血清中趋化因子水平异常升高而导致的副作用，这是设计此类疗法的重要考量。

综上所述，该研究不仅成功开发了针对 CCL25 的高效调节剂，还开创性地展示了如何利用配体结合蛋白来精细调控 GPCR 的信号偏倚和受体选择性，为免疫调节药物的开发开辟了新途径。