Combining xenium in situ spatial transcriptomics and imaging mass cytometry on a single tissue section

该研究开发了一种在单张福尔马林固定石蜡包埋组织切片上结合 Xenium 原位空间转录组学与成像质谱流式（IMC）技术的新型双平台工作流，证实了该流程在保持蛋白染色质量的同时，通过整合 RNA 与蛋白数据显著提升了单细胞分辨率下细胞景观及功能相互作用的解析深度。

要点

这篇论文讲述了一项非常酷的“双重侦探”技术，它让科学家能在同一块人体组织切片上，同时看清细胞的“基因蓝图”（RNA）和“蛋白质装备”（蛋白质）。

为了让你更容易理解，我们可以把这项研究想象成在一个繁忙的城市里，同时使用两种不同的侦察手段来调查居民。

1. 背景：为什么要搞“双重侦察”？

想象一下，你想知道一个城市（人体组织）里发生了什么。

• 方法 A（Xenium）： 就像是在检查每个人的日记本（RNA）。日记里写着他们“打算”做什么，或者他们“计划”制造什么工具。这能告诉你很多信息，但日记不等于现实，有时候人们写了计划却没执行。
• 方法 B（IMC）： 就像是在检查每个人身上实际穿戴的装备（蛋白质）。这直接反映了他们现在的状态和能力，但装备种类有限，你没法一次性看清所有细节。

以前，科学家只能选一种方法，或者把组织切成两半，一半用方法 A，一半用方法 B。但这有个大问题：就像把双胞胎分开，你很难确定左边那个和右边那个是不是完全一样的人。 组织切片稍微切偏一点，细胞分布就不同了，导致数据对不上。

2. 这项研究的突破：在“同一张脸”上同时做两件事

这篇论文的核心就是发明了一个**“先读日记，再查装备”的流程，而且是在同一张脸（同一块组织切片）**上完成的。

• 第一步（读日记）： 先用 10x Genomics 的 Xenium 技术，在组织上扫描并记录 377 种基因（RNA）的位置。这就像给每个细胞拍了一张“基因身份证”。
• 第二步（查装备）： 读完后，这张组织并没有被扔掉，而是直接拿去用 IMC（成像质谱流式细胞术） 技术，用 40 种金属标记的抗体去检测蛋白质。这就像给同一个细胞再拍一张“装备身份证”。

关键发现： 科学家原本担心，第一步的“读日记”过程（涉及高温、化学试剂）会不会把组织弄坏，导致第二步“查装备”时看不清？
结果： 完全不会！就像你读完一本书，把书合上，书皮依然完好无损，你可以接着在封面上贴标签。组织在经历了 Xenium 的复杂流程后，依然保持完整，IMC 的蛋白质检测效果依然清晰精准。

3. 有趣的发现：日记和装备并不总是一致

当科学家把两张“身份证”叠在一起看时，发现了一个有趣的现象：

• 宏观上： 日记里写的和身上穿的，大体方向是一致的。比如，如果日记里说“我是 T 细胞”，身上通常也穿着 T 细胞的制服。
• 微观上（单个细胞）： 经常有“言行不一”的情况。
  • 有的细胞日记里写着“我要战斗”（有相关基因），但身上却没穿战斗服（没检测到蛋白）。
  • 有的细胞身上穿着战斗服，但日记里却没写相关计划。

这说明了什么？ 这就像一个人嘴上说“我要减肥”（基因表达），但手里还拿着汉堡（蛋白存在）；或者一个人默默在健身（蛋白存在），但还没发朋友圈（基因没检测到）。只有把“日记”和“装备”结合起来看，才能最准确地判断这个细胞到底是谁，它在干什么。

4. 最大的收获：谁在肿瘤里“真干活”？

研究者特别关注了T 细胞（免疫系统的“警察”）。他们把细胞分成三组：

1. 只被“日记”识别的 T 细胞。
2. 只被“装备”识别的 T 细胞。
3. 既被“日记”确认，又被“装备”确认的 T 细胞。

结果发现，第 3 组（双重确认）的细胞最靠谱！

• 在肿瘤内部，只有那些“日记”和“装备”都显示活跃的 T 细胞，才真正表现出强大的杀伤力和战斗状态。
• 单靠一种方法识别的细胞，往往信息不全，可能会误判。

5. 总结：为什么要关心这个？

这项技术就像给科学家配了一副**“双焦眼镜”**：

• 一只眼看基因（潜力和计划）。
• 一只眼蛋白质（现实和状态）。

以前我们只能戴单片眼镜，现在可以360 度无死角地看清肿瘤微环境。这对于理解癌症、开发新药至关重要。它告诉我们，不要只听细胞“说什么”（基因），也不要只看细胞“穿什么”（蛋白），只有把两者结合起来，才能看清细胞真正的“内心戏”和“实际行动”。

一句话总结： 这项研究证明了我们可以用一套流程，在同一个组织切片上，既看基因又看蛋白，而且互不干扰。这让我们能更精准地识别细胞身份，看清它们在疾病（如癌症）中真正在做什么。

技术摘要

这是一份关于将 Xenium 原位空间转录组学与成像质谱流式细胞术（IMC）结合在单张组织切片上进行多组学分析的详细技术总结。

1. 研究背景与问题 (Problem)

• 单一模态的局限性： 现有的空间组学技术通常只能单独分析蛋白质（如成像质谱流式细胞术 IMC，最多约 40 种蛋白）或 mRNA（如 Xenium，最多约 5000 种转录本）。虽然蛋白质对于表型鉴定更可靠，但转录组能提供更广泛的分子覆盖。
• 空间信息的丢失： 传统的单细胞多组学方法（如 CITE-seq）虽然能同时获取蛋白和转录组信息，但会丢失组织样本的空间位置信息。
• 现有解决方案的不足： 目前市场上虽有能同时检测 mRNA 和蛋白的平台（如 CosMx 和 Xenium Protein），但其蛋白检测面板是预定义的，缺乏灵活性，无法根据特定研究需求定制蛋白面板。
• 技术挑战： 将两种不同的空间组学平台（Xenium 和 IMC）应用于同一张福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上存在巨大挑战。主要担忧包括：
  • Xenium 的复杂处理流程（如高温、化学试剂、循环成像）是否会破坏组织完整性或导致后续 IMC 蛋白染色质量下降？
  • 两种平台获取的数据在单细胞水平上的空间配准（Registration）和生物学一致性（Concordance）如何？

2. 方法论 (Methodology)

本研究开发并验证了一种新颖的“双平台工作流”，在单张 FFPE 组织微阵列（TMA）切片上依次进行 Xenium 和 IMC 分析。

• 样本准备： 使用来自黑色素瘤淋巴结的 FFPE TMA 样本。将组织切片分为两组：Slide A（用于 Xenium + IMC）和 Slide B（用于 Xenium + H&E 染色以评估组织完整性）。
• Xenium 空间转录组分析 (Slide A & B)：
  • 遵循 10x Genomics 标准流程，包括脱蜡、去交联、探针杂交、连接、扩增及循环成像。
  • 使用人类多组织/癌症表达面板（377 个基因靶点）。
  • 在 Xenium Analyzer 上进行成像和 onboard 分析，生成细胞分割掩膜（Cell Segmentation Mask）。
• IMC 成像质谱流式分析 (Slide A)：
  • 在 Xenium 运行完成后，对同一张 Slide A 进行 IMC 染色。
  • 关键步骤： 进行了抗原修复（微波加热）、封闭，然后使用 40 种金属标记抗体面板（涵盖免疫细胞、肿瘤细胞标志物等，如 SOX10, CD3, CD8, CD20 等）进行染色。
  • 使用 Hyperion 成像系统进行激光烧蚀和时间飞行质谱检测。
• 数据整合与分析：
  • 空间配准： 使用 Visiopharm 软件，通过手动放置 320 个地标点，将 Xenium 的 DAPI 核图像与 IMC 的 DNA-Ir 核图像进行对齐。
  • 细胞分割： 利用 Xenium 生成的细胞分割掩膜（基于核扩展）作为基准，将 IMC 蛋白数据映射到相同的细胞坐标上。
  • 细胞类型注释： 采用两种策略：(1) 基于单一标志物（如 CD3E/CD3）；(2) 基于半监督聚类（FuseSOM 和 clustSIGNAL）的多标志物综合分类。
  • 一致性分析： 比较仅由 Xenium 识别、仅由 IMC 识别以及由两者共同识别的细胞亚群，并分析其在肿瘤内与肿瘤外区域的生物学差异。

3. 主要贡献 (Key Contributions)

• 首创性工作流程： 首次证明了在单张 FFPE 组织切片上先进行 Xenium 转录组分析，随后进行 IMC 蛋白分析的可行性。
• 组织完整性验证： 证实了 Xenium 的循环成像和化学处理过程对后续 IMC 蛋白染色的影响极小，组织形态和抗原保留良好。
• 多模态数据整合策略： 提出了一种结合 RNA 和蛋白数据来定义细胞类型的策略，解决了单一模态在细胞鉴定上的局限性。
• 技术评估： 详细评估了两种平台在单细胞水平上的数据一致性、配准难度及生物学相关性。

4. 关键结果 (Key Results)

• 组织质量与染色可行性：
  • H&E 染色显示，经过 Xenium 流程后，组织形态保持完好，无明显组织丢失。
  • Xenium 后的 IMC 染色质量与单独进行 IMC 的相邻切片相当（如 SOX10 和 CD45 信号强度一致），表明该工作流不会显著降低蛋白检测灵敏度。
• 全局与单细胞水平的一致性：
  • 全局层面： Xenium 检测到的转录本分布与 IMC 检测到的对应蛋白分布高度相关（如 CD3E, CD20, Ki67）。
  • 单细胞层面： 存在显著差异。许多细胞在一种平台上显示阳性，而在另一种平台上为阴性。例如，CD20 的 RNA-蛋白相关性（r=0.48）优于 CD3（r=0.15）。这反映了生物学上的转录后调控以及各自平台的技术局限性（如分割误差、RNA 扩散）。
• 多模态细胞鉴定的优越性：
  • 仅依靠单一平台（Xenium 或 IMC）鉴定细胞类型时，结果往往偏向于该平台的优势（如 Xenium 倾向于高转录本表达，IMC 倾向于高蛋白表达）。
  • 核心发现： 当细胞被两种平台共同鉴定（即同时检测到 RNA 和蛋白）时，其生物学意义最明确。
  • 空间功能分析： 在肿瘤内部，被两种平台共同识别的 T 细胞显示出最高的激活、增殖（Ki67/MKI67）和效应功能（Granzyme B/GZMB, PD-1/PDCD1）标志物表达。相比之下，仅由单一平台识别的 T 细胞在功能特征上表现不一致（例如，仅 Xenium 识别的 T 细胞可能显示高转录本但低蛋白）。

5. 意义与影响 (Significance)

• 更全面的细胞景观视图： 该工作流克服了单一组学技术的盲点，通过整合 RNA 和蛋白数据，提供了对细胞表型、功能和相互作用更准确、更深层的理解。
• 解决技术瓶颈： 为研究人员提供了一种灵活的方法，可以在保留空间信息的同时，利用定制化的蛋白面板（IMC）和高通量转录组（Xenium）进行互补分析，弥补了商业一体化平台在蛋白面板定制上的不足。
• 生物学洞察： 研究表明，依赖单一模态可能导致对细胞群体的误判。结合多模态数据能更准确地揭示肿瘤微环境中 T 细胞的功能状态（如肿瘤内与肿瘤外 T 细胞的功能差异），对于理解免疫治疗反应和疾病机制至关重要。
• 未来方向： 尽管存在配准（Registration）和细胞分割（Segmentation）的技术挑战，该研究为未来的空间多组学整合奠定了技术基础，并强调了开发更精确的配准算法和细胞分割工具（如结合膜染色）的必要性。

总结： 该论文成功建立并验证了一种在单张 FFPE 切片上串联 Xenium 和 IMC 的技术流程。研究证明，尽管单细胞水平存在 RNA-蛋白表达的不一致性，但通过整合两种模态的数据，特别是识别出同时具备 RNA 和蛋白特征的细胞群，能够获得最具生物学意义的空间功能图谱，极大地提升了空间多组学研究的深度和准确性。