Fixative eXchange (FX)-seq: Scalable Single-nucleus RNA Sequencing Analysis of PFA-fixed or FFPE Tissue

该研究提出了一种名为 FX-seq 的高可扩展性单核 RNA 测序方法，通过利用有机催化剂去除交联并引入铂基交叉保护，成功克服了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）及多聚甲醛（PFA）固定组织样本中逆转录产率低的难题，实现了对数十万细胞核的异质性分析及其与病理注释的整合，为临床回顾性研究和精准医疗提供了强大工具。

要点

这篇论文介绍了一种名为 FX-seq 的新技术，它就像一把神奇的“万能钥匙”，能够打开医学档案室里那些沉睡已久的“时间胶囊”，让我们看清细胞内部的秘密。

为了让你更容易理解，我们可以把这项技术想象成修复一本被水浸泡、字迹模糊且被胶水粘住的古老日记。

1. 背景：为什么我们需要这项技术？

想象一下，医院里有一个巨大的档案室，里面存放着过去几十年甚至上百年的病人组织样本（比如切下来的肿瘤或脑组织）。这些样本都被泡在福尔马林（一种防腐剂）里，然后封在石蜡块中保存。这就像把日记本泡进了强力胶水里，又用石蜡封死。

• 问题：以前，科学家想读取这些样本里的基因信息（就像阅读日记），但发现根本读不出来。因为福尔马林把细胞里的 RNA（遗传信息的信使）像用胶水粘住一样，死死地固定住了，导致机器无法“翻译”它们。
• 现状：虽然有些旧方法能读一点，但要么读不全（像只读了几个字），要么只能读特定的内容（像只读了日记里的日期，没读内容），而且很难大规模使用。

2. 解决方案：FX-seq 是怎么工作的？

FX-seq 就像是一个高明的修复团队，它分三步走，把这本“被胶水粘住的日记”重新修好：

第一步：用“化学橡皮擦”擦掉胶水（去交联）

• 比喻：福尔马林留下的胶水（交联）让 RNA 无法工作。传统的办法是用高温“烘烤”来软化胶水，但这就像用火烤日记本，容易把纸（RNA）烧焦。
• FX-seq 的做法：他们发明了一种特殊的有机催化剂（就像一种温和的“化学橡皮擦”）。这种橡皮擦能在温和的温度下，精准地把粘在 RNA 上的“胶水”擦掉，让 RNA 恢复自由，同时不会损伤纸张。

第二步：给 RNA 穿上“防漏网衣”（防止泄漏）

• 比喻：当你把粘在墙上的纸撕下来时，纸很容易碎掉或者掉渣（RNA 泄漏）。
• FX-seq 的做法：在擦掉旧胶水之前，他们先给 RNA 穿上一件特制的“防漏网衣”（使用一种特殊的铂基化学交联剂）。这件网衣专门粘在 RNA 的特定位置，像网兜一样把 RNA 牢牢兜住，防止在后续清洗过程中丢失。

第三步：穿上“防弹衣”对抗破坏者（抑制酶）

• 比喻：在修复过程中，空气中或容器里可能藏着一些“破坏分子”（RNase 酶），它们会像白蚁一样把 RNA 吃掉。
• FX-seq 的做法：他们加入了一种便宜又高效的“防弹衣”（PVSA，一种化学抑制剂）。它能像盾牌一样挡住这些“白蚁”，保护 RNA 不被破坏，而且比之前昂贵的蛋白质盾牌更耐用、更便宜。

3. 成果：这把钥匙打开了什么？

有了这套“修复组合拳”，科学家们成功做到了以前不敢想的事情：

• 读取“陈年旧账”：他们不仅分析了新鲜的组织，还成功分析了石蜡包埋的旧样本（FFPE），甚至是已经染过色（H&E 染色）的切片。这意味着病理医生在显微镜下看过的切片，现在可以直接用来做基因测序，不需要重新切新鲜组织。
• 看清“细胞社区”：他们分析了超过 30 万个细胞核。就像在一个拥挤的社区里，以前只能看到“有人住”，现在能分清谁是“医生”、谁是“老师”、谁是“学生”。
  • 例子 1（大脑）：在老鼠大脑里，他们精准地分出了不同类型的神经元，甚至能区分出那些以前混在一起的“双胞胎”细胞。
  • 例子 2（癌症）：在一个对药物产生耐药性的胃癌患者样本中，他们发现了癌细胞是如何“进化”出抵抗力的。就像侦探一样，他们追踪到了癌细胞在药物压力下，偷偷改变了基因策略（比如改变了 DNA 的“包装方式”），从而逃过了药物的追杀。
• 结合“地图”定位：他们还能把基因数据和病理医生的“地图”（哪里是肿瘤，哪里是正常组织）结合起来。这就像给每个细胞都贴上了 GPS 定位，告诉我们“这个坏细胞就住在肿瘤区的第 3 栋楼”。

4. 为什么这很重要？

这项技术就像给医学界装上了时光机和显微镜：

1. 挖掘历史宝藏：全球有数十亿份存档的病理样本。以前它们只是“死”的石头，现在 FX-seq 能让它们“活”过来，告诉我们过去几十年里人类疾病发生了什么变化。
2. 精准医疗：医生不需要再让病人重新挨一刀取新鲜组织。只需要用以前切下来的旧切片，就能分析出癌症的具体亚型，从而制定更精准的治疗方案。
3. 动物实验更简单：以前做动物实验，必须立刻把动物解剖取新鲜组织，非常麻烦且容易出错。现在，科学家可以把动物全身灌注福尔马林固定，像保存标本一样保存好，以后随时拿出来做基因分析，结果更稳定。

总结来说：
FX-seq 就像是一个超级修复师，它用温和的化学手段，把被“时间”和“防腐剂”封印的细胞信息重新释放出来。这让科学家能够利用过去几十年的医学档案，去探索人类疾病的奥秘，为未来的精准治疗打开了一扇全新的大门。

技术摘要

这篇论文介绍了一种名为 Fixative eXchange (FX)-seq 的新型单核 RNA 测序（snRNA-seq）技术，旨在解决临床福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本及重交联多聚甲醛（PFA）固定样本中单细胞转录组分析长期面临的挑战。

以下是对该论文的详细技术总结：

1. 研究背景与核心问题 (Problem)

• 临床样本的宝贵性： 全球拥有数十亿份 FFPE 组织存档，这些样本是病理诊断和长期储存的主要资源，蕴含巨大的单细胞转录组学价值。
• 技术瓶颈： 传统的单细胞/单核 RNA 测序在 FFPE 或重 PFA 固定样本上效果不佳。主要原因是：
  • 逆转录（RT）产率低： PFA 固定会在核酸的氨基上形成甲基醇加合物（methylol adducts），阻碍沃森 - 克里克碱基配对，导致逆转录酶停滞或提前终止。
  • RNA 泄漏： 在去除交联的温和加热过程中，RNA 容易从细胞/核中泄漏。
  • RNA 降解： 样本处理过程中的 RNase 污染或自溶会导致 RNA 降解。
  • 现有方法的局限： 现有的方法（如 snPATHO-seq, snRandom-seq, snFFPE-seq）存在探针偏差、rRNA reads 过多、可扩展性差或依赖剧烈热处理导致 RNA 降解等问题。

2. 方法论：FX-seq 技术原理 (Methodology)

FX-seq 通过化学手段与可扩展的测序策略相结合，实现了高质量的数据获取。其核心步骤包括：

• 有机催化剂介导的交联去除 (Organocatalyst-mediated Decrosslinking)：
  • 采用一种新型有机催化剂（Cat. 2），在温和条件下（55°C）高效去除 PFA 形成的甲基醇加合物，恢复 RNA 的碱基配对能力，从而显著提高逆转录效率。
  • 相比之前的催化剂，Cat. 2 具有更优的反应动力学。
• 区域特异性 Pt(II) 交联防止 RNA 泄漏 (Regiospecific Pt(II) Crosslinking)：
  • 在去除 PFA 加合物之前，先使用一种合成的钌/铂基交联剂（基于顺铂衍生物与 PEG 连接偶联）。
  • 该交联剂特异性地结合鸟嘌呤的 N7 位点（Guanine-N7），在不干扰碱基配对的前提下，为 RNA 提供额外的锚定，防止在后续温和加热去除 PFA 过程中 RNA 从细胞核中泄漏。
• 高效且经济的 RNase 抑制剂 (RNase Inhibition)：
  • 引入聚乙烯磺酸 (PVSA) 作为 RNase 抑制剂。PVSA 是一种热稳定的化学抑制剂，通过竞争性结合 RNase 的活性位点来发挥作用。
  • 相比昂贵的蛋白类抑制剂，PVSA 成本更低，且不会在 RNA 上留下加合物，有利于提高原位逆转录产率，并能耐受 FX-seq 过程中的加热步骤。
• 组合式条形码标记 (Combinatorial Barcoding)：
  • 结合改进的 sci-RNA-seq3 协议，利用组合条形码技术对大量细胞核进行标记，实现了高通量、可扩展的单核测序。

3. 主要贡献与关键发现 (Key Contributions & Results)

A. 方法优化与验证

• HeLa 细胞验证： 证明了 Cat. 2 催化剂能有效提高 cDNA 合成产率，而 Pt 交联剂能有效减少 RNA 泄漏。PVSA 在加热条件下对 RNA 的保护效果优于传统抑制剂。
• 小鼠脑组织（PFA 固定）： 对经 PFA 灌注固定 48 小时的小鼠脑组织进行分析。FX-seq 成功恢复了被掩盖的转录组信息，检测到的基因数和 UMI 数量显著高于对照组（未处理、仅 Tris 缓冲、仅催化剂处理）。能够清晰区分神经元亚型（如中型多棘神经元 MSN 与抑制性中间神经元）。
• 性能对比： FX-seq 处理的重固定样本数据质量（UMI 和基因计数）与新鲜提取且轻固定的样本具有可比性，且避免了新鲜样本中常见的细胞质污染（线粒体和 rRNA 读数较低）。

B. 临床样本应用

• FFPE 块与切片： FX-seq 成功应用于小鼠脑 FFPE 块、4μm 和 10μm 的 FFPE 切片以及 H&E 染色切片。尽管切片会导致部分 RNA 损失，但 FX-seq 仍能恢复清晰的细胞类型图谱，并与 FFPE 块数据高度一致。
• 人类临床样本：
  • 膀胱癌转移灶： 从人类转移性膀胱癌 FFPE 样本中成功获取高质量数据。
  • 胃肠道间质瘤 (GIST)： 对经过 5 年酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼）治疗产生耐药的 GIST 样本进行了大规模分析（约 17 万个细胞核）。
    • 发现了罕见的免疫细胞群（如 cDC, pDC）。
    • 通过拟时序分析（PAGA）揭示了肿瘤细胞从正常 Cajal 间质细胞向增殖性肿瘤细胞转化的两条路径，并发现了与伊马替尼耐药相关的表观遗传修饰（DNA 甲基化）和异常基因表达（如生殖系特异性基因）。
  • 结直肠癌 (CRC)： 结合病理学家对肿瘤（T）和非肿瘤（NT）区域的标注，进行了空间分辨的 snRNA-seq 分析。
    • 成功区分了肿瘤细胞和上皮祖细胞，并通过 inferCNV 分析了拷贝数变异（CNV）。
    • 鉴定了肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞（CAF）亚群，并确定了肿瘤的内部分子亚型（iCMS2_MSS_F）。

4. 技术优势与意义 (Significance)

• 解锁“沉睡”的档案： FX-seq 使得利用全球数十亿份 FFPE 存档样本进行单细胞分辨率的转录组学研究成为可能，无需重新采集新鲜组织。
• 高可扩展性与成本效益： 结合化学优化和组合条形码，该方法能够处理大规模队列研究（如人类癌症队列）和大型动物模型研究。
• 精准医疗与药物研发：
  • 能够分析长期储存的样本，追踪疾病进展和药物耐药性的分子机制（如 GIST 耐药研究）。
  • 通过整合病理诊断（H&E 染色）与单细胞转录组，实现了从组织形态学到分子特征的精准关联，为癌症亚型分类和个性化治疗提供新工具。
• 动物研究改进： 允许通过 PFA 灌注固定动物，永久保护转录组，消除了新鲜组织解离过程中的应激反应和 RNA 降解，提高了实验的可重复性。
• 安全性： PFA 固定过程可灭活病原体，使得 FX-seq 能够安全地分析具有传染性的样本。

总结

FX-seq 通过创新的化学策略（有机催化剂去交联、Pt 交联防泄漏、PVSA 抑制 RNase）解决了 FFPE 和重固定样本中 RNA 提取和逆转录效率低的核心难题。该方法不仅显著提升了数据质量，还展示了在多种临床和动物模型中的广泛适用性，为利用历史存档样本推动精准医学和疾病机制研究开辟了新的道路。