Optimisation of Xenium automated in situ sequencing for PAXgene-fixed tissue samples

ملخص تقني: تحسين تسلسل Xenium الآلي في الموقع لعينات الأنسجة المثبتة بـ PAXgene

المشكلة
بينما أحدثت تقنيات النسخ المتماثل المكاني (spatial transcriptomics) ثورة في دراسة التعبير الجيني ضمن سياقات الأنسجة، إلا أن تطبيقها ظل مقتصرًا إلى حد كبير على العينات المجمدة الطازجة والعينات المثبتة بالفورمالين والمدمجة في البارافين (FFPE). ولا تزال طرق الحفظ غير القياسية غير مستكشفة بشكل كافٍ؛ وتحديدًا، يمثل التثبيت باستخدام PAXgene، الذي يحافظ على الحمض النووي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) دون الارتباط التشابكي المعتاد في الفورمالين، تحديات فريدة أمام عمليات النسخ المتماثل عالي الجودة في الموقع. وعلى الرغم من المزايا التي يوفرها التثبيت بـ PAXgene للدراسات الجينومية، فإن تطويع الأنسجة المثبتة بـ PAXgene والمدمجة في البارافين (PFPE) لتلائم منصات التسلسل الآلي في الموقع مثل Xenium يتطلب التغلب على عقبات كبيرة تتعلق بإمكانية الوصول إلى الـ RNA وسلامة الأنسجة.

المنهجية
لمعالجة هذه التحديات، طور المؤلفون سير عمل متخصصًا يسمى بروتوكول تحسين أنسجة Xenium (XTO). طُبق هذا النهج على أنسجة PFPE مشتقة من عينات متعددة من الفئران والبشر. تضمن جوهر المنهجية تقييمًا منهجيًا لظروف النفاذية لتحديد الوسيلة الأكثر فعالية لكشف الـ RNA لأغراض التسلسل. وكان المتغير الحاسم في عملية التحسين هو مدة الهضم بإنزيم البيبسين (pepsin digestion). حيث اختبر الباحثون مدد هضم مختلفة لتحديد الظروف التي تزيد من إمكانية الوصول إلى الـ RNA إلى أقصى حد، مع الحفاظ في الوقت ذات ذاته على السلامة الهيكلية للأنسجة وجودة الصبغ المورفولوجي (الشكلي).

المساهمات والنتائج الرئيسية
تُظهر الدراسة أن الهضم بالبيبسين يعد آلية فعالة لتعزيز إمكانية الوصول إلى الـ RNA في عينات PFPE. وقد كشف بروتوكول XTO أن مدد الهضم قابلة للضبط، مما يسمح بالتحسين النوعي لكل نسيج على حدة. ومع ذلك، يشير المؤلفون إلى وجود مقايضة ضرورية؛ إذ إن تعظيم معدلات اكتشاف النسخ المتماثل غالبًا ما يتطلب ظروفًا قد تؤثر على سلامة الأنسجة أو الصبغ المورفولوجي، مما يستلزم التوصل إلى حل وسط بناءً على الأهداف التجريبية المحددة.

وتشير النتائج في ظل هذه الظروف المحسنة إلى أن عينات PFPE يمكن أن تحقق معدلات اكتشاف لنسخ الـ RNA المكاني تضاهي، وفي بعض الحالات تتفوق على، تلك التي يتم الحصول عليها من عينات FFPE القياسية.

الأهمية
يوفر هذا العمل إطارًا ملموسًا لتطويع تقنيات التسلسل الآلي في الموقع لتناسب أنسجة PFPE. ومن خلال وضع سير عمل قابل للتطبيق لعينات مثبتة بـ PAXgene، تعمل هذه الدراسة على توسيع نطاق تطبيق تقنيات النسخ المتماثل المكاني. ويعد هذا التوسع مهمًا لكل من المجموعات الأرشيفية وعمليات جمع العينات المستقبلية، مما يمنح الباحثين مسارًا جديدًا للاستفادة من مواد PAXgene المثبتة في تحليل التعبير الجيني المكاني دون التضحية بجودة البيانات.