Optimisation of Xenium automated in situ sequencing for PAXgene-fixed tissue samples

Deze studie presenteert een geoptimaliseerde werkstroom met behulp van een nieuw pepsine-gebaseerd digestieprotocol (XTO) om het Xenium-geautomatiseerde in situ-sequencingplatform succesvol aan te passen voor PAXgene-gefixeerd weefsel, en toont aan dat deze monsters ruimtelijke RNA-transcriptdetectie kunnen bereiken die vergelijkbaar is met of superieur is aan standaard FFPE-monsters, terwijl de weefselmorfologie behouden blijft.

De kern

Stel je voor dat je probeert een bibliotheek van boeken te lezen, maar de boeken zitten opgesloten in een kluis. Wetenschappers hebben lange tijd twee belangrijkste sleutels gehad om deze kluis te openen: één voor "vers ingevroren" boeken en een andere voor "formaline-gefixeerde" boeken. Maar er is een derde type boek, bewaard in een speciale chemische stof genaamd PAXgene, dat grotendeels is genegeerd omdat de bestaande sleutels niet pasten. Deze speciale chemische stof is uitstekend voor het veilig houden van DNA en RNA (de "tekst" van het boek) zonder de pagina's aan elkaar te lijmen, maar het maakt het moeilijk om de woorden erin te lezen wanneer moderne, high-tech scanners worden gebruikt.

Dit artikel gaat over het vinden van een nieuwe sleutel om die PAXgene-boeken te openen, zodat ze kunnen worden gelezen door een krachtige nieuwe scanner genaamd Xenium. Denk aan Xenium als een supersnelle, geautomatiseerde robotbibliothecaris die precies kan in kaart brengen waar elk woord (gen) zich bevindt op een specifieke pagina (weefselmonster).

Hier is hoe de wetenschappers de puzzel hebben opgelost:

• Het probleem: De PAXgene-kluis was te strak. De "pagina's" (weefselcellen) zaten zo dicht op elkaar dat de robotbibliothecaris de woorden niet kon bereiken om ze te lezen.
• De oplossing: Het team creëerde een nieuw recept genaamd XTO (Xenium Tissue Optimisation). Ze behandelden de weefselmonsters met een spijsverteringsenzym genaamd pepsine.
• De analogie: Stel je het weefsel voor als een dichte, kleverige bal van klei. Om de woorden erin te lezen, moet je de klei net genoeg verzachten om de pagina's uit elkaar te halen zonder het hele boek in pap te veranderen. De wetenschappers ontdekten dat pepsine werkt als een zachte, precieze oplosmiddel. Het "verteert" precies de juiste hoeveelheid van het kleverige materiaal om de RNA (de woorden) toegankelijk te maken.
• De balans: Ze ontdekten dat timing alles is. Als je pepsine te kort laat werken, blijven de woorden verborgen. Als je het te lang laat werken, valt het boek uit elkaar en verlies je het beeld van hoe het weefsel eruit zag. Ze moesten de "Goudlokjes"-zone vinden – net genoeg vertering om de genen duidelijk te zien, maar niet zo veel dat de weefselstructuur wordt vernietigd.
• Het resultaat: Toen ze de timing goed hadden, werkten de PAXgene-monsters niet alleen; ze presteerden even goed als, of zelfs beter dan, de standaard formaline-gefixeerde monsters. De robotbibliothecaris kon meer woorden vinden in de PAXgene-boeken dan in de traditionele exemplaren.

Kort samengevat: Het artikel bewijst dat we met een nieuwe, zorgvuldig getimede "verterings"-stap nu geavanceerde gen-kaarttechniek kunnen toepassen op een type weefselmonster (PAXgene) dat eerder moeilijk te gebruiken was. Dit opent de deur voor wetenschappers om deze techniek toe te passen op zowel oude archieven als nieuwe collecties van deze specifieke monsters, waardoor de bibliotheek aan gegevens die ze kunnen bestuderen, wordt uitgebreid.

Technische samenvatting

Technische Samenvatting: Optimalisatie van geautomatiseerde Xenium in situ-sequencing voor PAXgene-gefixeerd weefsel

Het Probleem
Hoewel ruimtelijke transcriptomics de studie van genexpressie binnen weefselcontexten heeft revolutionair veranderd, is de toepassing grotendeels beperkt tot vers ingevroren en formaline-gefixeerd, paraffine-ingebedde (FFPE) monsters. Het gebruik van niet-standaard conserveringsmethoden blijft onderbelicht. Specifiek vormt PAXgene-fixatie, die DNA en RNA behoudt zonder de kruisverbindingen die kenmerkend zijn voor formaline, unieke uitdagingen voor hoogwaardige ruimtelijke transcriptomics. Hoewel voordelig voor genomische studies, vereist het aanpassen van PAXgene-gefixeerd, paraffine-ingebedde (PFPE) weefsels aan geautomatiseerde in situ-sequencingplatforms zoals Xenium het overwinnen van aanzienlijke barrières op het gebied van RNA-toegankelijkheid en weefselintegriteit.

Methodologie
Om deze uitdagingen aan te pakken, ontwikkelden de auteurs een gespecialiseerde workflow met de naam het Xenium Tissue Optimisation (XTO)-protocol. Deze aanpak werd toegepast op PFPE-weefsels afkomstig van meerdere muizen- en menselijke monsters. De kern van de methodologie bestond uit een systematische evaluatie van permeabilisatiecondities om de meest effectieve manier te bepalen om RNA bloot te leggen voor sequencing. Een kritieke variabele in deze optimalisatie was de duur van de pepsine-verteiding. De onderzoekers testten verschillende verteidingsduren om condities te identificeren die de RNA-toegankelijkheid maximaliseerden, terwijl de structurele integriteit van het weefsel en de kwaliteit van de morfologische kleuring behouden bleven.

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten
De studie toont aan dat pepsine-verteiding een effectief mechanisme is voor het verbeteren van RNA-toegankelijkheid in PFPE-monsters. Het XTO-protocol onthulde dat verteidingsduren instelbaar zijn, wat weefsel-specifieke optimalisatie mogelijk maakt. De auteurs merken echter een noodzakelijke afweging op: het maximaliseren van transcriptdetectiesnelheden vereist vaak condities die de weefselintegriteit of de morfologische kleuring kunnen beïnvloeden, wat een compromis vereist op basis van specifieke experimentele doelen.

Onder deze geoptimaliseerde condities geven de resultaten aan dat PFPE-monsters ruimtelijke RNA-transcriptdetectiesnelheden kunnen bereiken die vergelijkbaar zijn met, of in sommige gevallen superieur aan, die welke worden verkregen uit standaard FFPE-monsters.

Betekenis
Dit werk biedt een concreet kader voor het aanpassen van geautomatiseerde in situ-sequencingtechnologieën aan PFPE-weefsels. Door een levensvatbare workflow voor PAXgene-gefixeerde monsters te vestigen, verbreedt de studie de toepasbaarheid van ruimtelijke transcriptomics. Deze uitbreiding is significant voor zowel archiefcollecties als toekomstige monsterverzameling, en biedt onderzoekers een nieuwe weg om PAXgene-gefixeerd materiaal te benutten voor ruimtelijke genexpressie-analyse zonder in te leveren op datakwaliteit.