Amplicon-based targeted next generation sequencing (tNGS) for Mycobacterium tuberculosis - unpacking the 'black box'

تُعد السل عدواً قديماً تطور ليتخفى في وضح النهار، حيث ينجو داخل جسم الإنسان، والأخطر من ذلك، يتعلم كيفية مقاومة الأدوية المصممة لقتله. وعندما تصبح البكتيريا المسببة لهذا المرض مقاومة للأدوية القياسية، يصبح العلاج بمثابة لغز عالي المخاطر؛ إذ يجب على الأطباء تحديد الأدوية التي ستفشل بدقة وسرعة حتى يتمكنوا من الانتقال إلى مزيج آخر أكثر قوة قبل أن ينتشر العدوى أو تتدهور حالة المريض. ولعقود من الزمن، كان المعيار الذهبي لحل هذا اللغز هو استزراع البكتيريا في طبق مختبري، وهي عملية قد تستغرق أسابيع. وفي السنوات الأخيرة، طور العلماء طرقاً أسرع لقراءة الشفرة الوراثية للبكتيريا مباشرة من عينة المريض، متجاوزين وقت الانتظار الخاص باستزراع المزارع. ومع ذلك، فإن العديد من هذه الاختبارات السريعة الجديدة تشبه "الصناديق السوداء" المختومة: فهي تعمل، لكن مستخدميها لا يستطيعون رؤية ما بداخلها لفهم كيفية عملها أو تعديلها لأنواع جديدة من المقاومة.

لقد فتح فريق من الباحثين في سيدني أحد هذه الصناديق السوداء. فقد بنوا نسختهم الخاصة من الاختبار الجيني السريع الذي يتميز بالشفافية الكاملة والقابلية للتكيف، والمصمم لقراءة الشفرة الوراثية لبكتيريا السل مباشرة من عينات البلغم دون الحاجة لزراعة البكتيريا أولاً. وباستخدام تقنية تقوم بتسلسل خيوط الحمض النووي (DNA) أثناء مرورها عبر مسام دقيقة، ابتكر الفريق اختباراً يبحث عن تغيرات جينية محددة تُعرف بقدرتها على جعل البكتيريا مقاومة لستة عشر نوعاً مختلفاً من الأدوية. وكان هدفهم هو معرفوا ما إذا كانت هذه الأداة المصممة خصيصاً يمكنها تحديد ليس فقط الأدوية التي ستفشل، بل وأيضاً العائلة أو السلالة المحددة للبكتيريا، كل ذلك في غضون يوم واحد. وقد اختبروا طريقتهم مقابل الطرق الأبطأ والمعتمدة، ووجدوا أنه عندما يكون الحمل البكتيري في العينة مرتفعاً بما يكفي، يمكن لاختبارهم الجديد تحديد سلالة البكتيريا وملف مقاومة الأدوية الخاص بها بدقة عالية، مما يطابق نتائج أكثر الاختبارات الجينية شمولاً المتاحة.

بدأ الباحثون بتصميم مجموعة من "البادئات الجينية" (primers)، والتي تعمل مثل خطافات جزيئية دقيقة للإمساك بأجزاء محددة من جينوم السل ونسخها. وقد اختاروا أربعة وأربعين موقعاً جينياً مختلفاً لفحصها؛ حيث يساعد موقع واحد في تأكيد وجود بكتيريا السل، ويساعد اثنا عشر موقعاً في تحديد العائلة التي تنتمي إليها البكتيريا، وثلاثة وثلاثون موقعاً هي "بؤر ساخنة" معروفة حيث تسبب الطفرات مقاومة لمختلف الأدوية. تغطي هذه المواقع الثلاثة والثلاثون المقاومة للأدوية الشائعة من الخط الأول، وكذلك الأدوية الأحدث التي تُستخدم كملجأ أخير. ولجعل العملية فعالة، قاموا بتنظيم أزواج البادئات الثمانية والتسعين المطلوبة لتغطية هذه المناطق في ثلاث مجموعات منفصلة، لضمان إمكانية نسخها جميعاً في وقت واحد دون أن تتداخل مع بعضها البعض.

ولمعرفة مدى حساسية اختبارهم، قام الفريق أولاً بتجريبه على سلالة آمنة ومعروفة من البكتيريا في بيئة محكومة. وقاموا بتخفيف الحمض النووي حتى أصبح بالكاد قابلاً للكشف، واختبروا حدود أقل كمية من المواد الوراثية التي يمكن للآلة التعامل معها. ووجدوا أن الاختبار يعمل بشكل موثوق عندما يوجد ما لا يقل عن مائة نسخة من جينوم البكتيريا في كل ميكرولتر من العينة. عند هذا المستوى، نجح الاختبار في قراءة الغالبية العظمى من المناطق الوراثية المستهدفة، مما وفر بيانات كافية لإجراء تشخيص واثق. وعندما انخفضت كمية الحمض النووي عن هذا الحد، أصبح الاختبار أقل اتساقاً، حيث فُقدت بعض التفاصيل الجينية اللازمة للتشخيص الكامل. وقد وضع هذا حداً واضحاً لأداء الاختبار: فهو أداة قوية للعينات التي تحتوي على كمية كبيرة من البكتيريا، لكنه يعاني عندما يكون الحمل البكتيري منخفضاً جداً.

انتقل الفريق بعد ذلك إلى عينات من العالم الحقيقي، حيث أخذوا ثلاث وستين عينة من البلغم وسوائل الرئة من مرضى تم تشخيص إصابتهم بالسل بالفعل. ولكل عينة، قارنوا اختبارهم السريع الجديد مقابل نتائج المزارع المختبرية القياسية وأكثر طرق التسلسل الجيني تقدماً المتاحة حالياً. وأظهرت النتائج توافقاً قوياً بين الاختبار الجديد والطرق المعتمدة، ولكن فقط في العينات التي تكون فيها البكتيريا وفيرة. ففي العينات التي كانت فيها البكتيريا كثيرة، حدد الاختبار الجديد ملف مقاومة الأدوية بشكل صحيح في معظم الحالات تقريباً. كما حدد عائلة البكتا بشكل صحيح في كل مرة كانت فيها العينة تحتوي على قدر كافٍ من المادة الوراثية. ومع ذلك، في العينات التي تحتوي على عدد أقل من البكتيريا، غال باً ما فشل الاختبار في جمع معلومات كافية لتقديم إجابة واضحة، مما يسلط الضاف على أنه بينما التكنولوجيا سريعة، إلا أنها لا تزال تعتمد على وجود كمية كافية من الحمض النووي البكتيري لتعمل.

أظهرت حالة دراسية معينة الإمكانات التي يمكن أن يوفرها هذا النهج في سياق سريري حقيقي. فقد قدم مريض مصاب بعدوى معقدة ومقاومة للأدوية عينة تم اختبارها باستخدام الطريقة الجديدة. وفي غضون ست ساعات، حدد الاختبار العائلة المحددة للبكتيريا وتنبأ بمقاومتها لعدة أدوية، بما في ذلك بعض الأدوية التي غالباً ما تفوتها الاختبارات السريعة القياسية. وطابقتت النتائج تماماً التحليل اللاحق للبكتيريا المستزرعة، مما أكد أن النهج السريع الخالي من الاستزراع يمكن أن يوفر صورة كاملة للعدوى في جزء ضئيل من الوقت. وهذه السرعة أمر بالغ الأهمية لأنها تسمح للأطباء ببدء العلاج الصحيح في وقت أقرب بكثير، مما قد ينقذ الأرواح ويوقف انتشار السلالات المقاومة.

نظر الباحثون أيضاً في الجانب العملي لاستخدام هذه التكنولوجيا، حيث قاموا بحساب التكلفة والوقت المستغرق. ووجدوا أن العملية فعالة للغاية عندما يتم تشغيل العديد من العينات معاً، مما يخفض التكلفة إلى مستوى يمكن إدارته لكل عينة واحدة. ومع ذلك، إذا قام مختبر بتشغيل عينة واحدة فقط في كل مرة، فستكون التكلفة أعلى بكثير بسبب النفقات الثابتة للمعدات والكواشف. وهذا يشير إلى أن الاختبار مناسب بشكل أفضل للمختبرات التي يمكنها معالجة دفعات من العينات، بدلاً من الاختبارات المنفردة والمعزولة. وأشار الفريق إلى أنه على الرغم من أن اختبارهم يمثل خطوة كبيرة للأمام، إلا أنه ليس بديلاً لجميع الطرق الموجودة. ففي الأماكن التي تكون فيها البكتيريا نادرة جداً في العينة، أو حيث تبرز الحاجة إلى تتبع جيني أكثر شمولاً للمراقبة الصحية العامة، قد تظل الطرق الأخرى ضرورية.

في نهاية المطاف، يوفر هذا العمل مخططاً واضحاً ومفتوحاً لطريقة أسرع لمحاربة السل المقاوم للأدوية. فمن خلال إنشاء اختبار يتسم بالشفافية والقابلية للتخصيص، أظهر الباحثون أنه من الممكن تجاوز فترة الانتظار الطويلة للمزارع المختبرية التقليدية دون التضحية بالدقة، بشرط أن تحتوي العينة على كمية كافية من البكتيريا. وتؤكد الدراسة أنه مع توفر القدر المناسب من المادة الوراثية، يمكن للاختبار السريع الخالي من الاستزراع رسم ملف المقاومة للبكتيريا بدقة، مما يوفر أداة قوية للأطباء لتوجيه قرارات العلاج بسرعة. وبينما لا تزال التحديات قائمة، خاصة مع العينات ذات الأعداد البكتيرية المنخفضة، فإن القدرة على "الرؤية داخل الصندوق الأسود" للاختبار الجيني وتكييفه مع الاحتياجات المحلية تمثل تقدماً كبيراً في المعركة المستمرة ضد السل.