Amplicon-based targeted next generation sequencing (tNGS) for Mycobacterium tuberculosis - unpacking the 'black box'

結核は、人体の中に生き延び、さらに危険なことに、自らを死滅させるための薬に抵抗する方法を学習しながら、目立たない場所で進化し続けてきた古の敵である。この疾患を引き起こす細菌が標準的な薬に対して耐性を持つようになると、治療は極めて重要なパズルとなる。医師は、感染が広がる前、あるいは患者の状態が悪化する前に、どの薬が効かないのかを正確に特定し、より強力な組み合わせへと素早く切り替えなければならない。数十年にわたり、このパズルを解くための黄金律となってきたのは、ラボのシャーレの中で細菌を培養することであり、そのプロセスには数週間を要する場合がある。近年、科学者たちは、培養のための待ち時間をスキップして、患者の検体から直接細菌の遺伝暗号を読み取る、より迅速な方法を開発してきた。しかし、これらの新しい迅速なテストの多くは、いわば「封印されたブラックボックス」のようなものである。それらは機能してはいるものの、それを使用する人々は、その内部がどのように機能しているのか、あるいは新しいタイプの耐性に合わせてどのように調整すべきなのかを知る術がない。

シドニーの研究チームは、これらの一つであるブラックボックスの一つを開いた。彼らは、培養を必要とせずに、痰のサンプルから結核菌の遺伝暗我を直接読み取ることができる、完全に透明で適応可能な、独自のバージョンの迅速遺伝子テストを構築した。DNA鎖が微細な孔（ポア）を通過する際に配列を決定する技術を用いて、チームは16種類の薬剤に対する耐性を生じさせることが知られている特定の遺伝的変化を探知するテストを作成した。彼らの目標は、このカスタムメイドのツールが、どの薬が効かないのかだけでなく、細菌の特定の系統（リネージュ）をも単一の日の中で正確に特定できるかどうかを確認することであった。彼らは彼らの手法を確立されたより低速な手法と比較検討し、サンプルの細菌負荷が十分に高い場合には、彼らの新しいテストが細菌の系統とその薬剤耐性プロファイルを高い精度で正しく特定できることを発見した。これは、現在利用可能な最も徹底的な遺伝子検査の結果と一致していた。

研究者たちはまず、結核ゲノムの特定の部分を捉えてコピーするための、分子の小さな「フック」として機能する遺伝子プライマーのセットを設計することから始めた。彼らは、調査対象とする44の異なる遺伝的位置を選択した。一つの箇所は結核菌の存在を確認するために役立ち、12箇所の箇所は細菌がどの家族に属するかを特定するのに役立ち、そして31箇所の箇所は、様々な薬への耐性を引き起こす変異のホットスポットとして知られている。これら31箇所の箇所は、一般的な第一選択薬および新しい最後の手段となる薬剤への耐性をカバーしている。プロセスを効率的にするために、彼らはこれら全ての領域をカバーするために必要な98組の異なるプライマーを、互いに干渉することなく同時にコピーできるように、3つの別々のグループ、すなわち「プール」に整理した。

テストの感度を確認するために、チームはまず、制御された環境下で既知の安全な菌株を用いてテストを行った。彼らは、機械が扱える最小限の遺伝物質の限界をテストするために、DNAを検出が困難なレベルまで希釈した。その結果、サンプル1マイクロリットルあたり少なくとも100コピーの細菌ゲノムが存在する場合、テストは信頼性を持って機能することを発見した。このレベルにおいて、テストは標的となる遺伝領域の大部分を正常に読み取り、確信を持って診断を下すのに十分なデータを提供した。DNAの量がこの閾値を下回ると、テストの一貫性が失われ、完全な診断に必要な遺伝的詳細を見落とすようになった。これにより、テストの性能に関する明確な境界が確立された。すなわち、このツールは細菌がかなりの量存在するサンプルには強力であるが、細菌負荷が非常に低い場合には苦戦するというものである。

次に、チームは実世界のサンプルへと移行し、すでに結核と診断されている患者から採取された63の痰および肺液の検体を扱った。各サンプルについて、彼らの新しい迅速テストを、標準的な細菌培養および現在利用可能な最も高度な遺伝子配列解析法と比較した。結果は、細菌が豊富なサンプルにおいてのみ、新しいテストと確立された手法との間に強い一致を示したが、細菌が豊富なサンプルでは、新しいテストはほぼすべてのケースで薬剤耐性プロファイルを正実に特定した。また、サンプルに十分な遺伝物質がある場合には、ほとんどの事例において細菌の家族を正しく特定した。しかし、細菌が少ないサンプルでは、テストは明確な回答を出すための十分な情報を収集できないことが多く、技術が迅速であっても、依然として機能するためには十分な細菌DNAに依存していることを浮き彫りにした。

ある特定のケーススタディは、実際の臨床現場におけるこのアプローチの可能性を実証した。複雑な薬剤耐性感染症を持つ患者のサンプルが、この新手法を用いてテストされた。6時間以内に、テストは細菌の特定の家族を特定し、標準的な迅速テストが見落としがちないくつかの薬剤を含む、複数の薬剤への耐性を予測した。その結果は、後に培養によって成長させた細菌の分析結果と完全に一致しており、培養フリーの迅速なアプローチが、感染の全体像を極めて短時間で提供できることを裏付けた。このスピードは、医師がより早い段階で正しい治療を開始することを可能にし、潜在的に命を救い、耐性菌の拡散を阻止するために極めて重要である。

研究者たちはまた、この技術を使用する際の現実的な側面についても、コストと時間を計算した。多くのサンプルをまとめて実行する場合、プロセスは非常に効率的であり、単一サンプルあたりのコストを管理可能なレベルに抑えられることが分かった。しかし、もし研究所が一度に一つのサンプルしか実行しない場合、機器や試薬の固定費用により、コストは大幅に高くなる。このことは、このテストが、単発のテストではなく、サンプルのバッチ処理ができる研究所に適していることを示唆している。チームは、彼らのテストが大きな進歩ではあるものの、既存のすべての手法に取って代わるものではないとも指摘した。サンプル中の細菌が極めて少ない場所や、公衆衛生上の監視のために最も包括的な遺伝的追跡が必要な場所では、他の手法が依然として必要となる可能性がある。

究極的に、この研究は、薬剤耐性結核と戦うための、より迅速で開かれたブループリント（設計図）を提供するものである。透明でカスタマイズ可能なテストを作成することで、研究者たちは、サンプルに十分な細菌が含まれている限り、伝統的なラボ培養の長い待ち時間を、精度を損なうことなく回避できることを示した。この研究は、適切な量の遺伝物質があれば、迅速な培養フリーのテストが細菌の耐性プロファイルを正確にマッピングでき、医師が迅速に治療決定を下すための強力なツールを提供できることを裏付けている。特に細菌数が少ないサンプルに関する課題は残っているものの、「ブラックボックス」とされる遺伝子検査の内部を覗き、地域のニーズに合わせて適応させる能力は、結核との継続的な戦いにおける重要な進展を象徴している。