Data Independent Acquisition Pipeline for Microbiome Samples (Microbe-DIA)
تقدم هذه الورقة مساراً محسناً، وقابلاً للتوسع، وفعالاً من حيث التكلفة لبروتينات الميكروبيوم (metaproteomics)، يجمع بين معايير استحواذ محسنة لتقنية الكروماتوغرافيا السائلة المرتبطة بمطياف الكتلة المتوالي (LC–MS/MS) وسير عمل الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA) عالي الكفاءة حاسوبياً والخالي من المكتبات، وذلك لتعزيز إنتاجية العينات والأداء الكمي دون الاعتماد على مكتبات طيفية تجريبية.
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
تُعد الميكروبات المهندسين غير المرئيين لعالمنا، فهي تعيش في تربتنا، وفي محيطاتنا، وحتى داخل أجسادنا. ولفهم ما تفعله هذه المجتمعات الصغيرة حقاً — كيف تفكك النفايات، أو تدور المغذيات، أو تؤثر على صحة الإنسان — ينظر العلماء إلى البروتينات التي تنتجها. فالبروتينات هي العمال الوظيفيون للحياة؛ وهي الآلات التي تنفذ المهام الضرية لبقاء الكائن الحي. ومع ذلك، فإن دراسة هذه البروتينات في حشد مختلط من آلاف الأنواع المختلفة أمر صعب للغاية؛ فالأمر يشبه محاولة الاستماع إلى محادثة واحدة في ملعب مليء بالناس الذين يصرخون في وقت واحد. إن العدد الهائل من الأنواع المختلفة والاختلافات الشاسعة في عدد وجود كل منها يجعل من الصعب تكوين صورة واضحة لنشاط المجتمع.
لسنوات، كانت الطريقة القياسية لدراسة هذه البروتينات هي طريقة تعمل مثل كشاف الضوء، حيث تختار الأصوات الأعلى صوتاً واحداً تلو الآخر. وتعمل هذه الطريقة بشكل جيد للعينات البسيطة، ولكنها في الميكروبيوم المعقد، تغفل عن الأصوات الأقل صخباً والأقل وفرة، مما يترك فجوات كبيرة في البيانات. أما النهج الأحدث، المعروف باسم "الاستحواذ المستقل عن البيانات" (data-independent acquisition)، فيحاول الاستماع إلى الجميع في وقت واحد عن طريق تقسيم طيف الصوت بأكمله إلى قطاعات عريضة. وبينما يلتقط هذا الأسلوب معلومات أكثر بكثير، إلا أنه كان تاريخياً بطيئاً جداً للدراسات الكبيرة ويتطلب مكتبة ضخمة ومعدة مسبقاً من الأصوات لفهم الضجيج. وبدون تلك المكتبة، كانت البيانات معقدة للغاية بحيث يصعب تحليلها، خاصة عند التعامل مع التنوع الجيني الهائل الموجود في البيئات الطبيعية.
لقد طور فريق من الباحثين في مختبر باسيفيك نورث ويست الوطني (Pacific Northwest National Laboratory) مسار عمل مبسط يحل هذه المشكلات، مما يسمح للعلماء بتحليل المجتمعات الميكروبية المعقدة بسرعة ودقة دون الحاجة إلى مكتبة موجودة مسبقاً. وقد اختبروا طريقتهم باستخدام نموذج مصمم بعناية لميكروبيوم، حيث تم خلط ببتيدات من ستة وأربعين سلالة بكتيرية مختلفة. وقد كان هذا النموذج بمثابة بيئة محكومة حيث عرف الباحثون بالضبط الأنواع الموجودة ونسبها، مما سمح لهم بالتحقق مما إذا كان بإمكان طريقتهم الجديدة تحديدها وقياسها بشكل صحيح.
قام الباحثون أولاً بتحسين الإعدادات في أجهزة مطياف الكتلة الخاصة بهم، وهي الأدوات المستخدمة لوزن وتحديد هذه البروتينات. واكتشفوا أن حجم "النافذة" المستخدمة لالتقاط شظايا البروتين كان أمراً حاسماً. فمن خلال استخدام نافذة أضيق، استطاعوا فصل الإشارات بشكل أوضح، وتحديد عدد أكبر بكثير من البروتينات مقارنة بالنوافذ الأوسع. ثم قارنوا طريقتهم الجديدة السريعة بالنهج التقليدي الأبطأ. تطلبت الطريقة التقليدية تقسيم العينة إلى اثني عشر جزءاً منفصلاً وتحليل كل منها لمدة ساعتين، مما يستغرق يوماً كاملاً من وقت الجهاز لعينة واحدة. في المقابل، قامت الطريقة الجديدة بتحليل العينة بأكملها في ست ساعات فقط. وعند تعديل ذلك بالنسبة للوقت، حددت الطريقة الجديدة ما يقرب من تسعة أضعاف عدد البروتينات في الساعة الواحدة مقارنة بالطريقة القديمة، مما أثبت أن السرعة لم تأتِ على حساب الدقة.
وللتعامل مع التحدي الحسابي المتمثل في البحث عبر قواعد بيانات ضخمة من البروتينات المحتملة، أنشأ الفريق عملية مكونة من خطوتين يطلقون عليها اسم "التحليل الميتابروتيومي مع المكتبة الخالية من الاستحواذ المستقل عن البيانات" (Metaproteomic Analysis with DIA Library-free)، أو اختصاراً (MADL). تعمل الخطوة الأولى كمرشح، حيث تضيق نطاق البحث ليشمل فقط المسارات البيولوجية الأساسية التي تشترك فيها معظم البكتيريا، مثل تلك المشاركة في إنتاج الطاقة وتضاعف الحمض النووي (DNA). وهذا يقلل بشكل كبير من حجم قاعدة البيانات التي يحتاج الكمبيوتر للبحث فيها. وبمجرد أن يحدد الكمبيوتر الكائنات الحية التي يُحتمل وجودها بناءً على هذه الوظائف الأساسية، فإنه يستخدم تلك القائمة لتنقيح البحث في خطوة ثانية، مع التركيز على الوظائف المحددة للكائنات المكتشفة. وقد سمح هذا النهج لهم بتحديد خمسة وعشرين نوعاً بنجاح من أصل ثمانية وعشرين نوعاً معروفاً في مزيج الاختبار الخاص بهم، حتى عند البحث في قاعدة بيانات تحتوي على ملايين البروتينات المحتملة من بيئات التربة والأمعاء.
كما تناولت الدراسة كيفية التعامل مع البروتينات التي تبدو متشابهة جداً عبر الأنواع المختلفة. ومن خلال استخدام طريقة منطقية لتعيين هذه البروتينات المشتركة للمصدر الأكثر احتمالاً، وجد الفريق أن بإمكانهم قياس وفرة آلاف البروتينات أكثر مما سبق. وقد أكدوا أن طريقتهم يمكنها إعادة بناء تكوين المجتمع الميكروبي بدقة، بما يتوافق مع النسب المعروفة للسلالات في مزيج الاختبار الخاص بهم. علاوة على على ذلك، اختبروا سير العمل هذا على جهاز مطياف كتلة أحدث وأسرع، وهو (Astral)، ووجدوا أنه يمكنه إكمال التحليل في أكثر من ساعة واحدة فقط مع الاستمرار في تحديد آلاف البروتينات بدقة عالية.
يُظهر هذا العمل أنه بات من الممكن الآن إجراء درسات واسعة النطلة وعالية الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية دون الوقوع في عقبة إنشاء مكتبات مخصصة أو قضاء أيام في وقت استخدام الجهاز. وقد أظهر الباحثون أنه من خلال الجمع بين إعدادات الأجهزة المحسنة واستراتيجية حسابية ذكية مكونة من خطوتين، يمكن للعلماء التقاط رؤية شاملة للوظيفة الميكروبية. وهذا يفتح الباب لدراسة كيفية تغير هذه المجتمعات بمرور الوقت أو استجابةً لظروف بيئية مختلفة بمستوى من التفصيل والسرعة لم يكن ممكناً الوصول إليه سابقاً. توفر هذه الطريقة وسيلة عملية وقابلة للتوسع للانتقال من مجرد سرد الميكروبات الموجودة إلى فهم ما تفعله بالضبط في الأنظمة البيئية المعقدة التي تسكنها.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.