Data Independent Acquisition Pipeline for Microbiome Samples (Microbe-DIA)
Diese Arbeit präsentiert eine optimierte, skalierbare und kosteneffiziente Pipeline für die Mikrobiom-Metaproteomik, die verbesserte LC–MS/MS-Akquisitionsparameter mit einem recheneffizienten, bibliotheksfreien Data-Independent-Acquisition-Workflow (DIA) kombiniert, um den Proben-Durchsatz und die quantitative Leistung zu steigern, ohne auf empirische Spektralbibliotheken angewiesen zu sein.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Mikroben sind die unsichtbaren Architekten unserer Welt; sie leben in unserem Boden, in unseren Ozeanen und sogar in unserem eigenen Körper. Um zu verstehen, was diese winzigen Gemeinschaften tatsächlich tun – wie sie Abfälle abbauen, Nährstoffe kreislaufen oder die menschliche Gesundheit beeinflussen –, schauen Wissenschaftler auf die Proteine, die sie produzieren. Proteine sind die funktionalen Arbeiter des Lebens; sie sind die Maschinen, die die Aufgaben ausführen, die für das Überleben eines Organismus notwendig sind. Es ist jedoch unglaublich schwierig, diese Proteine in einer gemischten Menge aus tausenden verschiedenen Arten zu untersuchen. Es ist, als versuche man, ein einzelnes Gespräch in einem Stadion voller Menschen zu hören, die gleichzeitig schreien. Die schiere Anzahl der verschiedenen Arten und die enormen Unterschiede darin, wie viele von jeder Art existieren, machen es schwierig, ein klares Bild der Aktivität der Gemeinschaft einzufangen.
Jahrelang war die Standardmethode zur Untersuchung dieser Proteine ein Verfahren, das wie ein Scheinwerfer wirkt und die lautesten Stimmen nacheinander herauspickt. Dieser Ansatz funktioniert gut bei einfachen Proben, aber in einem komplexen Mikrobiom übersieht er die leiseren, weniger häufig vorkommenden Stimmen, was große Lücken in den Daten hinterlässt. Ein neuerer Ansatz, bekannt als datenunabhängige Akquisition (Data-Independent Acquisition), versucht, alle gleichzeitig zu hören, indem er das gesamte Spektrum des Klangs in breite Segmente zerlegt. Während diese Methode weit mehr Informationen erfasst, war sie historisch gesehen zu langsam für große Studien und erforderte eine riesige, vorgefertigte Bibliothek von Klängen, um das Rauschen zu interpretieren. Ohne diese Bibliothek waren die Daten zu komplex für die Analyse, insbesondere beim Umgang mit der enormen genetischen Vielfalt, die in natürlichen Umgebungen zu finden ist.
Einem Team von Forschern am Pacific Northwest National Laboratory ist es nun gelungen, eine optimierte Pipeline zu entwickeln, die diese Probleme löst und es Wissenschaftlern ermöglicht, komplexe mikrobielle Gemeinschaften schnell und genau zu analysieren, ohne eine bereits existierende Bibliothek zu benötigen. Sie testeten ihre Methode anhand eines sorgfältig konstruierten Modells eines Mikrobioms, in dem Peptide von sechsundvierzig verschiedenen Bakterienstämmen gemischt wurden. Dieses Modell diente als kontrollierte Umgebung, in der die Forscher genau wussten, welche Arten vorhanden waren und in welchen Proportionen, was es ihnen ermöglichte, zu verifizieren, ob ihre neue Methode die Arten korrekt identifizieren und messen konnte.
Die Forscher optimierten zunächst die Einstellungen ihrer Massenspektrometer, also der Instrumente, die verwendet werden, um diese Proteine zu wiegen und zu identifizieren. Sie entdeckten, dass die Größe des „Fensters“, das verwendet wird, um die Proteinfragmente zu erfassen, entscheidend war. Durch die Verwendung eines schmaleren Fensters konnten sie die Signale klarer trennen und identifizierten signifikant mehr Proteine als mit breiteren Fenstern. Sie verglichen dann ihre neue, schnellere Methode mit dem traditionellen, langsameren Ansatz. Die traditionelle Methode erforderte es, die Probe in zwölf separate Teile aufzuspalten und jeden Teil zwei Stunden lang zu analysieren, was insgesamt einen vollen Tag an Instrumentenzeit für eine einzige Probe bedeutete. Im Gegensatz dazu analysierte die neue Methode die gesamte Probe in nur sechs Stunden. Wenn man dies auf die Zeit anpasst, identifizierte der neue Ansatz fast neunmal mehr Proteine pro Stunde als die alte Methode, was bewies, dass Geschwindigkeit nicht auf Kosten der Genauigkeit ging.
Um die rechnerische Herausforderung zu bewältigen, durch riesige Datenbanken potenzieller Proteine zu suchen, entwickelte das Team einen zweistufigen Prozess, den sie „Metaproteomic Analysis with DIA Library-free“ oder kurz MADL nennen. Der erste Schritt fungt als Filter, der die Suche auf nur die essenziellsten biologischen Pfade einschränkt, die fast allen Bakterien gemeinsam sind, wie etwa jene, die an der Energiegewinnung und DNA-Replikation beteiligt sind. Dies reduziert die Größe der Datenbank, die der Computer durchsuchen muss, drastisch. Sobald der Computer basierend auf diesen Kernfunktionen identifiziert hat, welche Organismen wahrscheinlich vorhanden sind, nutzt er diese Liste, um die Suche in einem zweiten Schritt zu verfeinern, indem er sich auf die spezifischen Funktionen der detektierten Organismen konzentriert. Dieser Ansatz ermöglichte es ihnen, fünfundzwanzig der achtundzwanzig bekannten Arten in ihrem Testgemisch erfolgreich zu identifizieren, selbst wenn sie gegen eine Datenbank suchten, die Millionen potenzieller Proteine aus Boden- und Darmumgebungen enthielt.
Die Studie befasste sich auch damit, wie mit Proteinen umzugehen ist, die verschiedenen Arten sehr ähnlich sehen. Durch die Anwendung einer logischen Methode, um diese gemeinsamen Proteine der wahrscheinlichsten Quelle zuzuordnen, stellte das Team fest, dass sie die Häufigkeit von tausenden mehr Proteinen als zuvor quantifizieren konnten. Sie bestätigten, dass ihre Methode die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft genau rekonstruieren konnte, wobei sie die bekannten Proportionen der Stämme in ihrem Testgemisch entsprachen. Darüber hinaus testeten sie diesen Arbeitsablauf an einem neueren, schnelleren Massenspektrometer, dem Astral, und fanden heraus, dass es die Analyse in etwas mehr als einer Stunde abschließen konnte, während es immer noch tausende Proteine mit hoher Präzision identifizierte.
Diese Arbeit zeigt, dass es nun möglich ist, groß angelegte High-Throughput-Studien mikrobieller Gemeinschaften durchzuführen, ohne den Engpass der Erstellung maßgeschneiderter Bibliotheken oder das Verbringen von Tagen an der Instrumentenzeit zu haben. Die Forscher zeigten, dass es durch die Kombination von optimierten Instrumenteneinstellungen mit einer intelligenten, zweistufigen computergestützten Strategie möglich ist, eine umfassende Sicht auf die mikrobielle Funktion zu gewinnen. Dies öffnet die Tür dazu, wie sich diese Gemeinschaften im Laufe der Zeit oder als Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen verändern, und zwar mit einem Detailgrad und einer Geschwindigkeit, die zuvor unerreichbar war. Die Methode bietet einen praktischen, skalierbaren Weg, um von der bloßen Auflistung dessen, welche Mikroben vorhanden sind, zu dem Verständnis darüber zu gelangen, was sie in den komplexen Ökosystemen, die sie bewohnen, tatsächlich tun.
Ertrinken Sie in Arbeiten in Ihrem Fachgebiet?
Erhalten Sie tägliche Digests der neuesten Arbeiten passend zu Ihren Forschungsbegriffen — mit technischen Zusammenfassungen, in Ihrer Sprache.