Skittles: A Multicolor Flow Cytometric Workflow for High-Throughput Characterization of Micro- and Nano-plastics
تقدم الورقة البحثية "Skittles"، وهو سير عمل للقياس التدفيقي الخلوي متعدد الألوان وعالي الإنتاجية، يتيح توصيفاً دقيقاً ومعيارياً وكمياً للمواد البلاستيكية الدقيقة والنانوية في المعلقات السائلة، مما يوفر تمييزاً وتعداداً وتحليلاً لتوزيع الحجم يعتمد على الفلورة، وتم التحقق من صحته مقابل المجهر وطيف رامان.
المؤلفون الأصليون:Rachel E. Lancaster, Zhe Qiang, Kristina D.A. Mojica
أصبح البلاستيك جزءًا دائمًا من العالم الحديث، حيث يُقدّر لمتانته وخفته، ومع ذلك فإن هذه المرونة نفسها تسمح له بالبقاء في البيئة لقرون. فبمجرد التخلص منه، لا تتلاشى هذه المواد ببساطة؛ بل تتفكك تحت تأثير الشمس والرياح والأمواج إلى قطع أصغر فأصغر. وبينما يُعرف الحطام المرئي الذي يخنق الشواطئ ويضر بالحياة البحرية جيدًا، إلا أن هناك طبقة خفية من التلوث تتمثل في الجسيمات المجهرية والمتناهية الصغر. هذه القطع الضئيلة، التي غالبًا ما تكون غير مرئية بالعين المجردة، منتشرة بكثرة في المحيطات والأنهار، لكن العلماء واجهوا صعوبة في عدّها أو تحديد تركيبتها لأن الطرق الحالية بطيئة وتتطلب جهدًا يدويًا كبيرًا، وغالبًا ما تغفل أصغر الجسيمات تمامًا. وبدون وسيلة لقياس هذا التلوث غير المرئي بسرعة ودقة، يظل من الصعب فهم الحجم الحقيقي للتهديد الذي يشكله على الأنظمة البيئية المائية.
ولحل هذه المشكلة، طور باحثون في جامعة جنوب ميسيسيبي طريقة جديدة تسمى "Skittles"، وهي سير عمل مصمم لعد وتحديد هذه الجسيمات البلاستيكية الصغيرة بسرعة ودقة فائقتين. ركز الفريق على الجسيمات التي يتراوح حجمها من حجم حبة الرمل وصولًا إلى حجم الفيروس، وهو مقياس تفشل فيه أدوات العد التقليدية غالبًا. ويتضمن جوهر نهجهم صبغة خاصة تلتصق بالبلاستيك ولا تلتصق بالمواد الأخرى، مما يجعل البلاستيك يتوهج ببراعة عند تعرضه لضوء محدد. ومن خلال الجمع بين هذه الصبغة المتوهجة وآلة يمكنها تحليل آلاف الجسيمات الفردية في تيار سائل كل ثانية، أنشأ الباحثون نظامًا يعمل مثل فرز عالي السرعة. هذه الآلة، المعروفة باسم مقياس التدفق الخلوي (flow cytometer)، تستخدم أشعة الليزر للكشف عن الضوء المتشتت الناتج عن كل جسيم ولون التوهج المنبعث من الصبغة، مما يسمح لها بالتمييز بين أنواع البلوستيك المختلفة وتقدير حجمها دون الحاجة إلى فحص كل منها تحت المجهر.
اختبر الباحثون هذه الطريقة باستخدام أنواع متنوعة من البلاستيك الموجودة في الطبيعة، بما في ذلك البولي إيثيلين، والبولي ستيرين، والبولي بروبيلين، والبولي إيثيلين تيريفثاليت، وهي مواد شائعة في الزجاجات والتغليف والألياف الاصطناعية. قاموا أولاً بتحسين العملية لضمان عمل الصبغة بشكل مثالي، حيث حددوا الكمية المناسبة لاستخدامها وأفضل طريقة لتحضير العينات بحيث يتوهج البلاستيك باستمرار. ووجدوا أن تسخين العينات ساعد الصبغة على الارتباط بالبلاستيك بشكل أكثر فعالية، مما جعل الإشارة أقوى وأكثر موثوقية. وعند إجراء اختباراتهم، أثبتت الطريقة دقة عالية، حيث استعادت أكثر من 100 بالمائة من الجسيمات البلاستيكية التي أضافوها إلى الماء في تجارب محكومة، وكانت الأعداد متسقة مع تباين ضئيل جدًا. وللتأكد من أن الطريقة لا تقوم فقط بعدّ الصبغة نفسها أو الحطام الآخر، قارنوا النتائج مع العد المجهري وتقنية التحليل الكيميائي المعروفة باسم "مطيافية رامان" (Raman spectroscopy)، وكلاهما أكد أن سير العمل الجديد كان يحدد المواد الصحيحة.
وعندما طبق الفريق هذه الط méthode على مياه البحر الحقيقية التي جُمعت من "ميسيسيبي ساوند"، كشفت النتائج عن وجود كثافة سكانية من الجسيمات البلاستيكية أكبر بكثير مما كان يُقدر سابقًا. احتوت المياه على مئات الجسيمات في كل ميليلتر، وهو رقم أعلى بكثير من التقارير السابقة التي كانت تركز غالبًا على الشظايا الأكبر والأكثر وضوحًا. نجحت الطريقة في تحديد مزيج من أنواع البلاستيك، حيث كان البولي بروبيلين والبولي ستيرين الأكثر شيوعًا، وتمكنت أيضًا من قياس حجم هذه الجسيمات، موضحة أنها تتراوح من الجسيمات النانوية الصغيرة جدًا إلى الميكروبلاستيك الأكبر حجمًا. كما اختبر الباحثون الطريقة على عينات من مياه الشرب التي جُمعت من المنازل، حيث اكتشفت كميات منخفضة ولكن قابلة للقياس من البلاستيك، مما أظهر حساسيتها حتى في المياه النظاء التي تحتوي على عدد قليل جدًا من الجسيمات. والأهم من ذلك، أظهرت الدراسة أن وجود الطحالب أو المواد العضوية الطبيعية الأخرى في الماء لم يؤثر بشكل كبير على القدرة على عد البلاستيك، مما يشير إلى أن الطريقة قوية بما يكفي للاستخدام في البيئات الطبيعية المعقدة.
تكمن أهمية هذا العمل في قدرته على تحويل مهمة بطيئة وصعبة إلى عملية سريعة ومعيارية. فقبل هذا التطوير، كان توصيف النطاق الكامل للتلوث البلاستيكي يتطلب أدوات متعددة وأيامًا من العمل اليدوي، وغالبًا ما كان يغفل أصغر الجسيمات وأكثرها عددًا. يسمح سير عمل "Skittles" لجهاز واحد بالتعامل مع المهمة بأكملية، مما يوفر صورة واضحة لعدد الجسيمات الموجودة، ونوع البلاستيك، وحجمها. وبينما تبلغ الطريقة حاليًا الأحجام بناءً على مقارنة بخرز بلاستيكي قياسي، وهي طريقة موثوقة لتقدير الحجم للجسيمات الكروية، يشير الباحثون إلى أن العمل المستقبلي سيكون مطلوبًا لتنقيح تقديرات الحجم هذه للأشكال غير المنتظمة وأنواع البلاستيك المختلفة. ومع ذلك، توفر هذه الأداة الجديدة وسيلة قوية لمراقبة الطبقة غير المرئية من التلوث البلاستيكي، مما يوفر البيانات اللازمة لفهم المخاطر التي تشكلها هذه الجسيمات على البيئة وتتبع كيفية تغير مستويات التلوث بمرور الوقت.
ملخص تقني: Skittles – سير عمل قياس التدفق متعدد الألوان للتوصيف عالي الإنتاجية للميكرو- والنانو بلاستيك
بيان المشكلة تُعد الجسيمات البلاستيكية الميكروية والنانوية (MNPs)، والتي تُعرف بأنها جزيئات بوليمر يقل حجمها عن 5 ملم، ملوثات بشرية المنشأ منتشرة في كل مكان ولها تهديدات كبيرة للأنظمة البيئية البحرية. وبينما تم توثيق وفرة البلاستيك الكلي (macroplastics) الأكبر حجماً بشكل جيد، فإن الوفرة الحقيقية، والتوزيع الحجمي، والتركيب للجزيئات الميكروية والنانوية الأصغر (خاصة تلك التي تقل عن 1 ميكرومتر) في الأنظمة الطبيعية لا تزال غير محددة بدقة. ويستمر هذه الفجوة المعرفية بسبب الافتقار إلى طرق تحليلية سريعة، وعالية الإنتاجية، ومعيارية قادرة على الكشف عن الـ MNPs وتحديد هويتها وقياسها بفعالية عبر نطاق واسع من الأحجام. تعتمد سير العمل الحالية غالباً على الجمع بين المجهر والتحليل الطيفي، وهي عمليات تتطلب جهداً بشرياً كبيراً، وتستغرق وقتاً طويلاً، وعادة ما تكون محدودة بالجسيمات التي يبلغ حجمها 1 ميكرومتر أو أكثر. علاوة على ذلك، لا توجد حالياً تقنية تحليلية واحدة قادرة على توصيف مجموعات الميكرو والنانو بلاستيك في آن واحد داخل المصفوفات البيئية المعقدة.
المنهجية: سير عمل "Skittles" يقدم المؤلفون "Skittles"، وهو سير عمل لتدفق الخلايا متعدد الألوان (MFCM) مصمم للتوصيف عالي الإنتاجية لـ MNPs في المعلقات السائلة. تعتمد المنهجية على المكونات الأساسية التالية:
الصبغ الفلوري: يستخدم سير العمل صبغة 4-dimethylamino-4'-nitrostilbene (DANS)، وهي صبغة فلورية ذات انزياح لوني (solvatochromic). تُظهر DANS أطياف انبعاث تنزاح عبر نطاق واسع من الأطوال الموجية (من الأزرق إلى الأحمر) اعتماداً على قطبية البوليمر البلاستيكي المرتبط بها. وتسمح هذه الخاصية بالتمييز بين أنواع البوليمرات المختلفة بناءً على أنماط انبعاث الفلورة المتميزة.
تحضير العينات: لتقليل التلوث الخلطي، تُجرى جميع الإجراءات تحت بروتوكولات غرف نظيفة صارمة باستخدام أدوات زجاجية ومعدنية. يتم معالجة الجسيمات البلاستيكية مسبقاً بـ Tween-20 لتقليل الكره للماء (hydrophobicity). كما يتم ترشيح محاليل DANS الخام (0.2 ميكرومتر) لإزالة جسيمات الصبغة غير الذائبة التي قد تسبب نتائج إيجابية كاذبة.
التحسين (Optimization): تم تحسين سير العمل فيما يتعلق بتركيز DANS (يعتمد على مساحة السطح)، والتسخين (80 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لتعزيز شدة الفلورة، خاصة للبولي ستيرين)، واستقرار التخزين. وتُعد محاليل DANS الطازجة مطلوبة، حيث تتحلل المحاليل المخزنة خلال 30 يوماً.
الأجهزة: يتم إجراء التحليل باستخدام جهاز قياس التدفق BD FACS-Celesta المزود بليزر بنفسجي (405 نانومتر)، وأزرق (488 نانومتر)، وأحمر (610 نانومتر). يتم تفعيل الكشف بناءً على قنوات فلورية محددة (V450/25، V525/50، B575/25) لاختيار الجسيمات المصبوغة مع تقليل الخلفية.
تحليل البيانات:
التمييز: تُستخدم مخططات ثنائية المتغير لـ التشتت الجانبي (Side Scatter - SSC) مقابل قنوات فلورية محددة للتمييز بين أربعة أنواع من البوليمرات: البولي ستيرين (PS)، البولي إيثيلين (PE)، البولي بروبيلين (PP)، والبولي إيثيلين تيريفثاليت (PET).
تحديد الحجم: يتم تقدير حجم الجسيمات باستخدام مساحة التشتت الجانبي (SSC-A) المعايرة مقابل معايير كرات البولي ستيرين (PS) المعتمدة (0.1–10 ميكرومتر). وتُنسب الأحجام كأقطار مكافئة للبولي ستيرين (PS-equivalent diameters).
التحقق من الصحة: يتم التحقق من صحة الطريقة مقابل المجهر الفلوري (epifluorescence microscopy) لعد الجسيمات، وضد مطيافية رامان (Raman spectroscopy) لتحديد نوع البوليمر.
المساهمات الرئيسية
جهاز واحد عالي الإنتاجية: يتيح سير عمل Skittles العد المتزامن، والتمييز القائم على الفلورة، وتوصيف الحجم لمجموعات MNPs غير المتجانسة (القطع، التكتلات، الألياف) في تحليل واحد، مما يقلل الحاجة إلى أجهزة متعددة.
نطاق حجم واسع: يوسع هذا الأسلوب قدرات التوصيف من النطاق النانوي (حتى ~30 نانومتر) إلى النطاق الميكروي (حتى ~20 ميكرومتر)، مما يعالج فجوة حرجة في قدرات الرصد الحالية.
التمايز بين البوليمرات: من خلال الاستفادة من الخصائص اللونية لـ DANS، نجح سير العمل في التمييز بين أربعة أنواع شائعة من البوليمرات (PS, PE, PP, PET) بناءً على بصماتها الفلورية المتميزة في إعداد قياس التدفق متعدد الألوان.
بروتوكول معياري: تقدم الورقة بروتوكولاً مُحسناً بدقة ومثبتاً تحليلياً، بما في ذلك ظروف الصبغ المحددة، وتكوينات الأجهزة، وخطوات معالجة البيانات.
النتائج
الأداء التحليلي: أظهر سير العمل دقة عالية بمعاملات تباين (CVs) عادة ما تكون أقل من 4%، ومعدلات استرداد كمية بمتوسط 103% (تتراوح بين 80-120% عبر المصفوفات المختلفة).
التحقق المتقاطع: لوحظ توافق قوي بين Skittles (MFCM) والمجهر الفلوري لعد الجسيمات عبر أنواع البوليمرات والتركيزات المختلفة (R² = 0.99). كما أكدت مطيافية رامان بشكل مستقل تصنيفات البوليمر في العينات البيئية.
التطبيق البيئي:
مياه البحر: كشف التطبيق على مياه ميسيسيبي ساوند (Mississippi Sound) عن تركيزات MNPs تتراوح بين 231 إلى 1,178 جسيماً لكل ملليلتر (المتوسط ~762 جسيماً/مل). كانت مجموعات PP و PS هي المجموعات المهيمنة المصنفة. وكانت هذه الأعداد أعلى بعدة مراتب من التقديرات السابقة للميكرو بلاستيك الأكبر حجماً، ويعزى ذلك إلى تضمين الجسيمات النانوية وتحت الميكرونية.
مياه الشرب: رصدت الطريقة وجود MNPs في عينات مياه الشرب (صنبور، مصفاة، معبأة) بتركيزات تتراوح بين 12.7 إلى 94.7 جسيماً لكل ملليلتر، مما أظهر حساسية في المصفوفات ذات الوفرة المنخفضة.
توصيف الحجم: وفر SSC-A مؤشراً قوياً لحجم الجسيمات، مع دقة تكرار عالية (CVs <6% حتى لكرات 100 نانومتر). وتدرجت شدة الفلورة خطياً مع SSC-A، مما أكد الصبغ المتماسك عبر كامل طيف الحجم.
الأهمية والادعاءات يدعي المؤلفون أن Skittles يؤسس منصة تحليلية عملية وعالية الإنتاجية لتوصيف الميكرو والنانو بلاستيك في البيئات المائية. ومن خلال دمج عد الجسيمات، والتمييز بين البوليمرات، وتقدير الحجم في سير عمل واحد، يقلل هذا الأسلوب بشكل كبير من التعامل مع العينات، ووقت التحليل، وخطر التلوث الخلطي مقارنة بالنهج التقليدي متعدد الأجهزة. وتثبت الدراسة أن سير العمل قابل للتطبيق على المصفوفات البيئية المعقدة والمتجوية، بما في ذلك مياه البحر الطبيعية ومياه الشرب. ويضع المؤلفون Skittles كأداة لتحسين الرصد البيئي وتقييم مخاطر التلوث البلاستيكي البيئي، وخاصة بالنسبة لجزء النانو بلاستيك الذي لم يتم توصيفه سابقاً بشكل كافٍ. وقد تم تحديد العمل المستقبلي كضرورة لتوسيع مكتبة المراجع البوليمرية وتوسيع معايرة التشتت لأنواع أخرى من البوليمرات.