First application of dPCR for Lentiviral Vector Copy Number and Post-infusion monitoring of TCR-Engineered Regulatory T Cells

إن الجهاز المناعي هو جيش داخلي هائل مصمم لحماية الجسم من الغزاة، ولكنه أحياناً يوجه أسلحته ضد المضيف، مما يسبب أمراض المناعة الذاتية مثل الذئبة الحمراء. في هذه الحالات، تهاجم دفاعات الجسم أنسجته السليمة عن طريق الخطأ، مثل الكلى. ولإيقاف ذلك، يعمل العلماء على تطوير علاجات تستخدم نوعاً معيناً من الخلايا المناعية يسمى الخلايا التائية التنظيمية. فكر في هذه الخلايا كأنها "حفظة السلام" في الجهاز المناعي؛ فوظيفتها الطبيعية هي تهدئة الاستجابات المناعية المفرطة واستعادة التوازن. وبينما ثبت أن إعطاء المرضى مزيجاً من حفظة السلام هؤلاء آمن، إلا أن النتائج كانت متواضعة، وغالباً ما تتلاشى بسرعة لأن الخلايا لا تكون مستهدفة بدقة كافية. ويتضمن النهج الأحدث هندسة هذه الخلايا للتعرف على بقع المشاكل المحددة في الجسم، مما يعني منحها خريطة للعثور على المصدر الدقيق للالتهاب وإيقافه. ومع ذلك، فإن صنع هذه الخلايا المتخصصة أمر صعب، وكان تتبع ما إذا كانت تعيش وتقوم بعملها بمجرد دخولها إلى المريض يمثل عقبة رئيسية أمام الباحثين.

ولحل هذه المشكلات، طور فريق من العلماء في جامعة موناش طريقة جديدة لعد وتتبع هذه الخلايا المهندسة بدقة أكبر بكثير. فقد ركزوا على نوع محدد من العلاجات حيث يتم تعديل الخلايا التائية التنظيمية لحمل تعليمات جينية، يتم إيصالها بواسطة ناقل فيروسي (lentiviral vector)، والذي يعمل مثل شاحنة توصيل تحمل مجموعة جديدة من المخططات. ويُعرف عدد هذه المخططات التي تنجح في الاستقرار داخل الخلية بـ "عدد نسخ الناقل"، وهو مقياس حاسم لمدى جودة صنع العلاج. لسنوات، استخدم الباحثون طريقة تسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لعد هذه النسخ، لكن هذه التقنية تعتمد على مراجع خارجية يمكن أن تؤدي إلى حدوث أخطاء، خاصة عندما تكون الأعداد صغيرة جداً. لذا لجأ الفريق إلى تقنية أحدث تسمى تفاعل البوليمراز المتسلسل الرقمي (digital PCR)، والتي تعدّ الجزيئات الفردية مباشرة، مما يوفر مستوى من الدقة لا يمكن للطريقة القديمة مضاهاته. ومن خلال تطبيق هذه الأداة، تمكنوا ليس فقط من التحقق من جودة الخلايا قبل إعطائها للمرضى، بل وأيضاً من تتبع رحلتها عبر الجسم بمرور الوقت.

بدأ الباحثون بمقارنة مدى قبول هذه التعليمات المهندسة من قبل نوعين مختلفين من الخلايا المناعية: الخلايا التائية التنظيمية، وهي "حفظة السلام"، والخلايا التائية التقليدية، وهي "الجنود العاديون". وعالجوا كلا المجموعتين بنفس الكمية من شاحنات التوصيل الفيروسية. ولدهشتهم، وجدوا أن خلايا "حفظ السلام" كانت أفضل بكثير في التقاط والاحتفاظ بهذه التعليمات. فعندما تعرضت الخلايا لكمية منخفضة من شاحنات التوصيل، انتهى الأمر بالخلايا التائية التنظيمية باحتواء نسخ أكثر بكثير من التعليمات الجينية مقارنة بالخلايا التقليدية. وظل هذا التفوق قائماً حتى عند زيادة كمية الشاحنات. كما تحقق الفريق من مدى قدرة الخلايا على التعبير عن التعليمات الجديدة من خلال مراقبة علامة خضراء متوهجة مرتبطة بالشحنة الجينية. ولم تكتفِ خلايا "حفظ السلام" بحمل نسخ أكثر فحسب، بل كانت تتوهج بشكل أكثر سطوعاً أيضاً، مما يشير إلى أنها تستخدم التعليمات بفعالية أكبر. ويشير هذا الاكتشاف إلى أن الخلايا التائية التنظيمية مهيأة طبيعياً لهذا النوع من الهندسة الجينية، مما قد يسمح للأطباء باستخدام عدد أقل من الشاحنات الفيروسية لتحقيق نفس التأثير القوي، مما قد يقلل التكاليف والمخاطر.

ولضمان موثوقية طريقة العد الجديدة الخاصة بهم، قارن الفريق نتائج تفاعل البوليمراز المتسلسل الرقمي مع الطريقة التجارية القياسية المستخدمة في العديد من المختبرات. ووجدوا أنه بينما اتفقت كلتا الطريقتين على الاتجاهات العامة، إلا أن الطريقة القديمة بالغت باستمرار في تقدير عدد النسخ بأكثر من الضعف. وفرت الطريقة الرقمية الجديدة صورة أوضح وأكثر دقة دون الحاجة إلى الاعتماد على منحنيات مرجعية خارجية. وهذه الدقة أمر حيوي لأن معرفة العدد الدقيق للنسخ الجينية يساعد العلماء على فهم سلامة وقوة العلاج. ومع امتلاك هذه الأداة التي تم التحقق من صحتها، انتقل الباحثون من مختبر التجارب إلى نظام حي لمعرفة ما سيحدث بعد إدخال الخلايا إلى الجسم. فاستخدموا نموذج فأر متخصص يحاكي التهاب الكلية الذئبي لدى البشر، لاختبار مدى بقاء خلايا "حفظ السلام" المهندسة هذه ووجهتها.

حقن الفريق الخلايا المهندسة في الفئران ثم تتبعها على مدار ستين يوماً عن طريق أخذ عينات دم صغيرة. وباستخدام طريقة العد الرقمي الجديدة، تمكنوا من اكتشاف البصمة الجينية المحددة لخلايا "حفظ السلام" طوال هذه الفترة بأكملها. وأظهرت البيانات أن الخلايا لم تكتفِ بالبقاء ساكنة؛ بل توسعت في العدد، ووصلت إلى ذروتها حول اليوم الثلاثين قبل أن تستقر. ولم يكن هذا التوسع خطاً مستقيماً بسيطاً؛ إذ اعتمد مقدار النمو على الجرعة الأولية المعطاة. فالفئران التي تلقت جرعة متوسطة من الخلايا أظهرت في الواقع ذروة أعلى في أعداد الخلايا في اليوم الثلاثين مقارنة بتلك التي تلقت جرعة منخفضة جداً أو عالية جداً. وهذا يشير إلى وجود "نقطة مثالية" للجرعات، حيث تمتلك الخلايا موارد كافية للتكاثر بفعالية دون الاصطدام بالمنافسة على العناصر الغذائية التي تحتاجها للبقاء على قيد الحياة.

وبعيداً عن الدم، أراد الباحثون معرفة أين تذهب هذه الخلايا داخل الجسم. فقاموا بفحص أعضاء مثل الطحال والكبد والرئتين والكلى في نهاية الدراسة. وُجدت الخلايا في جميع هذه المواقع، لكنها لم تتوزع بالتساوي. فقد وُجدت أعلى التركيزات في الطحال والرئتين، مع اعتماد الموقع المحدد للذروة على الجرعة المعطاة. ومن المثير للاهتمام أنه على الرغم من إصابة الفئران بالتهاب كلى شديد، إلا أن عدد خلايا "حفظ السلام" الموجودة في الكلى كان أقل مما هو موجود في الأعضاء الأخرى. وهذا يشير إلى أنه بينما يمكن للخلايا الانتقال إلى موقع الإصابة، إلا أنها قد لا تتراكم هناك بنفس كثافة تراكمها في الأعضاء اللمفاوية حيث يتم تدريب الجهاز المناعي. وتؤكد الدراسة أن هذه الخلايا المهندسة يمكن أن تستمر لمدة شهرين على الأقل وتنتشر في أنسجة مختلفة، لكنها تسلط الضوء أيضاً على أن سلوكها معقد ويتأثر بالجرعة والبيئة الخاصة بكل عضو.

يضع هذا العمل معياراً جديداً لكيفية صنع ومراقبة هذه العلاجات الخلوية المتقدمة. فمن خلال إثبات أن الخلايا التائية التنظيمية فعالة بطبيعتها في قبول التعليمات الجينية، حدد الفريق ميزة بيولوجية يمكن استخدامها لإنشاء علاجات أكثر قوة. علاوة على ذلك، من خلال إثبات أن تفاعل البوليمراز المتسلسل الرقمي يمكنه تتبع هذه الخلايا بدقة عالية سواء في مختبر التصنيع أو داخل جسم حي، فقد قدموا أداة موحدة تربط جودة المنتج بأدائه في المريض. وبينما أُجريت الدراسة على الفئران ولا يمكنها بعد التنبؤ بدقة بكيفية سلوك هذه الخلايا في البشر، إلا أنها تقدم خارطة طريق واضحة للتجارب السريرية المستقبلية. فهي تظهر أنه مع توفر الأدوات الصحيحة، يمكن للعلماء تجاوز التخمين لفهم عدد الخلايا الموجودة بالضبط، وأين توجد، وكيف تتغير بمرور الوقت، مما يقرب وعد العلاج المناعي المستهدف من أرض الواقع.