First application of dPCR for Lentiviral Vector Copy Number and Post-infusion monitoring of TCR-Engineered Regulatory T Cells

प्रतिरक्षा प्रणाली एक विशाल, आंतरिक सेना है जिसे शरीर को हमलावरों से बचाने के लिए बनाया गया है, लेकिन कभी-कभी यह अपने ही हथियारों को मेजबान (host) के विरुद्ध मोड़ देती है, जिससे ल्यूपस जैसी ऑटोइम्यून बीमारियाँ होती हैं। इन स्थितियों में, शरीर की अपनी रक्षा प्रणाली गलती से स्वस्थ ऊतकों, जैसे कि गुर्दे (किडनी), पर हमला करती है। इसे रोकने के लिए, वैज्ञानिक ऐसी उपचार पद्धतियाँ विकसित कर रहे हैं जो एक विशिष्ट प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिका का उपयोग करती हैं जिसे 'रेगुलेटरी टी सेल' (regulatory T cell) कहा जाता है। इन कोशिकाओं को प्रतिरक्षा प्रणाली के 'शांतिदूतों' (peacekeepers) के रूप में समझें; उनका प्राकृतिक कार्य अत्यधिक सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को शांत करना और संतुलन बहाल करना है। हालांकि मरीजों को इन शांतिदूतों का मिश्रण देना सुरक्षित साबित हुआ है, लेकिन इसके परिणाम मामूली रहे हैं, क्योंकि ये अक्सर जल्दी ही फीके पड़ जाते हैं क्योंकि कोशिकाएं पर्याप्त सटीकता से लक्षित नहीं होती हैं। एक नया दृष्टिकोण इन कोशिकाओं को शरीर के विशिष्ट समस्या वाले स्थानों को पहचानने के लिए इंजीनियर करने में शामिल है, जो अनिवार्य रूप से उन्हें सूजन के सटीक स्रोत को खोजने और रोकने के लिए एक मानचित्र प्रदान करता है। हालांकि, इन विशिष्ट कोशिकाओं को बनाना कठिन है, और एक बार रोगी के भीतर जाने के बाद वे जीवित रहती हैं या अपना काम करती हैं या नहीं, इसकी निगरानी करना शोधकर्ताओं के लिए एक बड़ी बाधा रही है।

इन समस्याओं को हल करने के लिए, मोनाश यूनिवर्सिटी के वैज्ञानिकों की एक टीम ने इन इंजीनियर की गई कोशिकाओं को बहुत अधिक सटीकता के साथ गिनने और ट्रैक करने का एक नया तरीका विकसित किया है। उन्होंने एक विशिष्ट प्रकार की थेरेपी पर ध्यान केंद्रित किया जहाँ रेगुलेटरी टी सेल्स को एक आनुवंशिक निर्देश प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जाता है, जिसे एक 'लेंटिविरल वेक्टर' (lentiviral vector) द्वारा पहुँचाया जाता है, जो नए ब्लूप्रिंट (नक्शों) को ले जाने वाले एक डिलीवरी ट्रक की तरह कार्य करता है। इन ब्लूप्रिंट्स की संख्या जो सफलतापूर्वक एक कोशिका के भीतर पहुँच जाती है, उसे 'वेक्टर कॉपी नंबर' (vector copy number) के रूप में जाना जाता है, और यह इस बात का एक महत्वपूर्ण पैमाना है कि थेरेपी कितनी अच्छी तरह से बनाई गई है। वर्षों से, शोधकर्ता इन प्रतियों को गिनने के लिए 'क्वांटिटेटिव पीसीआर' (quantitative PCR) नामक विधि का उपयोग करते रहे हैं, लेकिन यह तकनीक बाहरी संदर्भों (external references) पर निर्भर करती है जो त्रुटियां पैदा कर सकती हैं, विशेष रूप से तब जब संख्या बहुत कम हो। टीम ने 'डिजिटल पीसीआर' (digital PCR) नामक एक नई तकनीक की ओर रुख किया, जो सीधे व्यक्तिगत अणुओं को गिनती है, और यह उस स्तर की सटीकता प्रदान करती है जो पुरानी विधि के पास नहीं है। इस उपकरण को लागू करके, वे न केवल मरीजों को देने से पहले कोशिकाओं की गुणवत्ता की जांच करने में सक्षम थे, बल्कि समय के साथ शरीर के भीतर उनकी यात्रा का भी पता लगाने में सक्षम थे।

शोधकर्ताओं ने यह तुलना करने से शुरुआत की कि इन इंजीनियर किए गए निर्देशों को दो अलग-अलग प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा कितनी अच्छी तरह स्वीकार किया गया: रेगुलेटरी टी सेल्स, जो शांतिदूत हैं, और कन्वेंशनल टी सेल्स (conventional T cells), जो मानक सैनिक हैं। उन्होंने दोनों समूहों के साथ समान मात्रा में वायरल डिलीवरी ट्रक्स का उपचार किया। उन्हें आश्चर्य हुआ कि शांतिदूत कोशिकाएं इन निर्देशों को पकड़ने और रखने में कहीं अधिक बेहतर थीं। जब कोशिकाओं को डिलीवरी ट्रक्स की कम मात्रा के संपर्क में लाया गया, तो रेगुलेटरी टी सेल्स के पास कन्वेंशनल सेल्स की तुलना में आनुवंशिक निर्देशों की काफी अधिक प्रतियां थीं। यह लाभ तब भी बना रहा जब ट्रक्स की मात्रा बढ़ाई गई। टीम ने एक चमकते हुए हरे मार्कर (glowing green marker) को देखकर यह भी जांचा कि कोशिकाएं नए निर्देशों को कितनी अच्छी तरह व्यक्त करती हैं। शांतिदूत कोशिकाओं के पास न केवल अधिक प्रतियां थीं, बल्कि वे अधिक चमक भी रही थीं, जो यह दर्शाता है कि वे निर्देशों का अधिक प्रभावी ढंग से उपयोग कर रही थीं। यह खोज बताती है कि रेगुलेटरी टी सेल्स स्वाभाविक रूप से इस प्रकार की जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए बेहतर अनुकूल हैं, जिससे डॉक्टर समान शक्तिशाली प्रभाव प्राप्त करने के लिए कम वायरल ट्रक्स का उपयोग कर सकते हैं, जिससे संभावित रूप से लागत और जोखिम कम हो सकते हैं।

अपने नए गणना करने के तरीके को विश्वसनीय बनाने के लिए, टीम ने अपने डिजिटल पीसीआर परिणामों की तुलना कई प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग की जाने वाली मानक वाणिज्यिक विधि से की। उन्होंने पाया कि जबकि दोनों विधियाँ सामान्य रुझानों पर सहमत थीं, पुरानी विधि ने लगातार प्रतियों की संख्या को दोगुने से अधिक बढ़ा-चढ़ाकर दिखाया। नई डिजिटल विधि ने बिना किसी बाहरी संदर्भ वक्र (external reference curves) पर निर्भर हुए एक स्पष्ट और अधिक सटीक चित्र प्रदान किया। यह सटीकता अत्यंत महत्वपूर्ण है क्योंकि आनुवंशिक प्रतियों की सटीक संख्या जानना वैज्ञानिकों को थेरेपी की सुरक्षा और क्षमता को समझने में मदद करता है। इस प्रमाणित उपकरण के साथ, शोधकर्ता लैब से निकलकर एक जीवित प्रणाली की ओर बढ़े ताकि यह देखा जा सके कि कोशिकाओं को शरीर में डालने के बाद क्या होता है। उन्होंने एक विशेष माउस मॉडल का उपयोग किया जो मानव ल्यूपस नेफ्रैटिस (lupus nephritis), गुर्दे की सूजन के एक गंभीर रूप, की नकल करता है, ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि ये इंजीनियर किए गए शांतिदूत कितने समय तक जीवित रहते हैं और वे कहाँ जाते हैं।

टीम ने इंजीनियर की गई कोशिकाओं को चूहों में इंजेक्ट किया और फिर साठ दिनों की अवधि तक रक्त के छोटे नमूने लेकर उन्हें ट्रैक किया। अपने नए डिजिटल गणना पद्धति का उपयोग करके, वे इस पूरी अवधि के दौरान शांतिदूत कोशिकाओं के विशिष्ट आनुवंशिक हस्ताक्षर का पता लगाने में सक्षम थे। डेटा ने दिखाया कि कोशिकाएं केवल स्थिर नहीं रहीं; वे संख्या में बढ़ीं, और तीसवें दिन के आसपास अपने शिखर (peak) पर पहुँचीं और फिर स्थिर हो गईं। यह विस्तार एक सरल सीधी रेखा नहीं थी; विकास की मात्रा दी गई प्रारंभिक खुराक पर निर्भर थी। जिन चूहों को कोशिकाओं की मध्यम खुराक दी गई थी, उनमें बहुत कम या बहुत अधिक खुराक दिए गए चूहों की तुलना में तीसवें दिन कोशिकाओं की संख्या में वास्तव में उच्च शिखर देखा गया। यह सुझाव देता है कि खुराक देने के लिए एक 'स्वीट स्पॉट' (sweet spot) होता है, जहाँ कोशिकाओं के पास प्रभावी ढंग से बढ़ने के लिए पर्याप्त संसाधन होते हैं, बिना जीवित रहने के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के लिए प्रतिस्पर्धा में फंसे।

रक्त के अलावा, शोधकर्ता यह जानना चाहते थे कि ये कोशिकाएं शरीर के भीतर कहाँ जाती हैं। उन्होंने अध्ययन के अंत में प्लीहा (spleen), यकृत (liver), फेफड़े और गुर्दे जैसे अंगों की जांच की। कोशिकाएं इन सभी स्थानों पर पाई गईं, लेकिन वे समान रूप से वितरित नहीं थीं। उच्चतम सांद्रता प्लीहा और फेफड़ों में पाई गई, और शिखर का विशिष्ट स्थान दी गई खुराक पर निर्भर था। दिलचस्प बात यह है कि भले ही चूहों में गुर्दे की गंभीर सूजन थी, लेकिन अन्य अंगों की तुलना में गुर्दे में शांतिदूत कोशिकाओं की संख्या कम थी। यह इंगित करता है कि हालांकि कोशिकाएं चोट के स्थान तक यात्रा कर सकती हैं, लेकिन वे उन लिम्फॉइड अंगों (lymphoid organs) की तुलना में वहां उतनी भारी मात्रा में जमा नहीं होती हैं जहाँ प्रतिरक्षा प्रणाली प्रशिक्षित होती है। अध्ययन इस बात की पुष्टि करता है कि ये इंजीनियर की गई कोशिकाएं कम से कम दो महीने तक बनी रह सकती हैं और विभिन्न ऊतकों में फैल सकती हैं, लेकिन यह यह भी उजागर करता है कि उनका व्यवहार जटिल है और खुराक एवं अंग के विशिष्ट वातावरण से प्रभावित होता है।

यह कार्य इन उन्नत सेल थेरेपी को बनाने और निगरानी करने के लिए एक नया मानक स्थापित करता है। यह सिद्ध करके कि रेगुलेटरी टी सेल्स स्वाभाविक रूप से आनुवंशिक निर्देशों को स्वीकार करने में कुशल हैं, टीम ने एक जैविक लाभ की पहचान की है जिसका उपयोग अधिक शक्तिशाली उपचार बनाने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रदर्शित करके कि डिजिटल पीसीआर इन कोशिकाओं को निर्माण प्रयोगशाला और जीवित शरीर दोनों में उच्च सटीकता के साथ ट्रैक कर सकता है, उन्होंने एक एकीकृत उपकरण प्रदान किया है जो उत्पाद की गुणवत्ता को रोगी के प्रदर्शन से जोड़ता है। हालांकि यह अध्ययन चूहों पर किया गया था और यह अभी तक सटीक भविष्यवाणी नहीं कर सकता कि ये कोशिकाएं मनुष्यों में कैसे व्यवहार करेंगी, फिर भी यह भविष्य के नैदानिक परीक्षणों (clinical trials) के लिए एक स्पष्ट रोडमैप प्रदान करता है। यह दिखाता है कि सही उपकरणों के साथ, वैज्ञानिक अनुमान लगाने से आगे बढ़कर यह समझ सकते हैं कि कितनी कोशिकाएं मौजूद हैं, वे कहाँ हैं, और वे समय के साथ कैसे बदल रही हैं, जिससे लक्षित प्रतिरक्षा चिकित्सा (targeted immune therapy) का वादा वास्तविकता के करीब आ रहा है।