Bacillus coagulans inoculation generates an alternative microbial succession trajectory associated with nitrogen preservation and aerobic stability in alfalfa silage
تُظهر هذه الدراسة أن تلقيح سيلاج البرسيم الحجازي ببكتيريا *Bacillus coagulans* يؤسس مسار تعاقب ميكروبي فريد ومرحلي يتفوق على التلقيح التقليدي ببكتيريا *Lactiplantibacillus plantarum* من خلال تعزيز حفظ النيتروجين بشكل كبير وإطالة الاستقرار الهوائي عبر تحولات وظيفية متميزة في إنتاج الأسيتات والاحتفاظ بالمغذيات.
المؤلفون الأصليون:Junming Lu, Jinlong Xu, Wenjing Wei, Qingshan Fan, Ting Jiao, Shengguo Zhao, Jie Bai
تخيل حقلًا من البرسيم الحجازي، وهو محصول أخضر نضير يثمنه المزارعون لمحتواه العالي من البروتين، والذي يغذي أبقار الحليب والماشية الأخرى. وللحفاظ على طزاجة هذا العلف القيم خلال فصل الشتاء، غالبًا ما يقوم المزارعون بتقطيعه وتعبئته بإحكام في أكياس أو أبراج محكمة الإغلاق، وهي عملية تسمى "التخمير اللاهوائي" (ensiling). داخل هذه البيئة المختومة، تخضع المواد النباتية لعملية تخمير طبيعية، حيث تقوم كائنات مجهرية بتفكيك السكريات وإنتاج أحماض تعمل على حفظ الغذاء. ومع ذلك، فإن البرسيم الحجازي صعب الحفظ بشكل ملحوظ؛ فبسبب غناه بالبروتين وانخفاض السكريات اللازمة للتخمر، غالبًا ما يفشل في التخمض بسرعة كافية. وهذا يسمح للبكتيريا غير المرغوب فيها بتفكيك البروتين الثمين إلى منتجات ضارة، مما يقلل من القيمة الغذائية للعلف. علاوة على ذلك، بمجرد فتح كيس التخزين ودخول الهواء، يمكن للعلف أن يفسد بسرعة، حيث يسخن ويتعفن بسبب نشاط الخمائر والأعفان. لقد كان التحدي الذي واجه العلماء لفترة طويلة هو إيجاد طريقة لتوجيه هذا العالم المجهري بحيث يظل البروتين سليمًا ويظل العلف مستقرًا حتى بعد كسر الختم.
سعى باحثون في جامعة غانسو الزراعية في الصين لحل هذا اللغز من خلال اختبار كيف تغير المساعدات المجهرية المختلفة، المعروفة باسم "الملقحات" (inoculants)، مسار التخمر في البرسيم الحجازي. وقارنوا بين علاج قياسي يستخدم بكتيريا حمض اللاكتيك الشائعة وبين نهج جديد يستخدم نوعًا مختلفًا من البكتيريا يسمى "باسيلوس كوجولانس" (Bacillus coagulans)، بالإضافة إلى مزيج من كليهما. كان الهدف هو معرفة أي طريقة تحفظ البروتين بشكل أفضل وتحافظ على استقرار العلف عند تعرضه للهواء. وكشفت الدراسة أن نوعي البكتيريا يخلقان مسارات مختلفة تمامًا للمجتمع الميكروبي ليسلكها. فبكتيريا حمض اللاكتيك التقليدية تعمل بسرعة، حيث تخفض حموضة العلف بسرعة وتسيطر على البيئة فورًا تقريبًا. وفي المقابل، يخلق علاج "باسيلوس كوجولانس" عملية تدريجية ومرحلية حيث تتناوب أنواع مختلفة من البكتيريا، مما يؤدي إلى تركيز أعلى من حمض الخليك، وهو نوع مختلف من الأحماض الحافظة.
أظهرت النتائج أنه بينما نجحت بكتيريا حمض اللاكتيك سريعة المفعول في خفض الرقم الهيدروجيني (pH) في وقت مبكر، إلا أنها لم تحمِ البروتين بقدر ما فعل علاج "باسيلوس كوجولانس". فبعد ستين يومًا من التخزين، احتفظ السيلاج المعالج بـ "باسيلوس كوجولانس" بأعلى كمية من البروتين الخام وأقل مستويات من نفايات النيتروجين. والأهم من ذلك، عندما فتح الباحثون الأكياس وعرضوا العلف للهواء لاختبار استقراره، أصبح الفرق أكثر وضوحًا. فالمجموعة الضابطة، التي لم تتلقَ أي علاج، بدأت في السخونة والفساد بعد أربعين ساعة فقط. أما السيلاج المعالج ببكتيريا حمض اللاكتيك سريعة المفعول فقد استمر لفترة أطول، حيث صمد لمدة مائة وخمس ساعات تقريبًا قبل ظهور علامات الفساد. ومع ذلك، فإن السيلاج المعالج بـ "باسيلوس كوجولانس"، والمزيج الذي يحتوي عليه، ظل مستقرًا لمدة مائة وثلاث وثلاثين ساعة. ويشير هذا إلى أن وجود حمض الخليك، وهو أكثر فعالية في محاربة الخمائر والأعفان التي تسبب الفساد عند التعرض للهواء، كان العامل الرئيسي في الحفاظ على طزاجة العلف.
ولفهم سبب حدوث ذلك، نظر العلماء في أعماق المجتمعات الميكروبية باستخدام التسلسل الجيني المتقدم. ووجدوا أن بكتيريا حمض اللاكتيك سريعة المفعول خلقت مجتمعًا بسيطًا للغاية يهيمن عليه نوع واحد من الميكروبات. وبينما كان هذا جيدًا لصنع الحمض بسرعة، إلا أنه ترك النظام عرضة للخطر بمجرد عودة الهواء. أما علاج "باسيلوس كوجولانس"، فقد دعم مجتمعًا أكثر تنوعًا وتحولاً. سمح هذا التنوع للسيلاج بالحفاظ على توازن أفضل للأحماض والحفاظ على وظائف جينية محددة تتعلق باستقلاب النيتروجين والكبريت. وعند إدخال الهواء، تمكن المجتمع في سيلاج "باسيلوس كوجولانس" من التكيف محليًا دون الانهيار، بينما عانى السيلاج غير المعالج من انهيار واسع في بنيته الميكروبية. وتخلص الدراسة إلى أن الحفاظ على العلف عالي البروتين لا يقتصر فقط على جعل العلف حمضيًا بأسرع وقت ممكن، بل يعتمد النجاح بدلاً من ذلك على توجيه المجتمع الميكروبي عبر تسلسل محدد من التغيات التي تبني بيئة مرنة، بيئة يمكنها حماية البروتين أثناء التخزين وتحمل صدمة التعرض للهواء عندما يصبح العلف جاهزًا للأكل.
بيان المشكلة يُعد البرسيم الحجازي (Medicago sativa L.) محصولاً علفياً حيوياً عالي البروتين، ولكنه يطرح تحديات كبيرة أثناء عملية التخمير السيلاجي (ensiling) بسبب قدرته العالية على التخزين المؤقت (buffering capacity)، وانخفاض تركيز الكربوهيدرات الذائبة في الماء (WSC)، ونشاط الإنزيمات البروتينية النباتية. وتؤدي هذه الخصائص غالباً إلى بطء التحمض، والتحلل البروتيني الواسع (الذي يؤدي إلى فقدان النيتروجين)، وعدم الاستقرار الهوائي الضعيف عند فتح الصومعة. وبينما تُستخدم ملقحات بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) مثل Lactiplantibacillus plantarum على نطاق واسع لتسريع عملية التحمض، فإن الانخفاض السريع في الرقم الهيدروجيني (pH) في المراحل المبكرة لا يضمن دائماً الحفاظ الأمثل على النيتروجين أو مقاومة التلف الهوائي في الركائز ذات المحتوى البروتيني العالي والـ WSC المنخفض. علاوة على ذلك، فإن الآليات الوظيفية التي تؤثر بها الملقحات البديلة، مثل Bacillus coagulans، على التعاقب الميكروبي، وتدفق الكربون، والاحتفاظ بالنيتروجين عبر كل من المراحل اللاهوائية والهوائية، لا تزال غير واضحة بشكل كافٍ، لا سيما فيما يتعلق بالارتباط بين بنية المجتمع والإمكانات الوظيفية للميتاجينوم.
المنهجية استخدمت الدراسة تجربة صومعة حقيبة (bag silo) على نطاق مختبري باستخدام برسيم حجازي تم حصاده في مرحلة الإزهار المبكر وتجفيفه حتى وصل محتوى المادة الجافة (DM) إلى حوالي 350 جم/كجم. تمت مقارنة أربعة معاملات:
CK: مجموعة الضبط غير الملقحة.
LP: ملقح بـ Lactiplantibacillus plantarum MTD/1 (1×106 وحدة تشكيل مستعمرة/جم وزن طازج).
BC: ملقح بـ Bacillus coagulans (1×106 وحدة تشكيل مستعمرة/جم وزن طازج).
BL: تلقيح مشترك لـ LP و BC (5×105 وحدة تشكيل مستعمرة/جم لكل منهما).
تم جمع العينات في الأيام 3، 15، و60 من التخمير اللاهوائي، مع جمع عينات إضافية بعد 7 أيام من التعرض للهواء. تضمن التصميم التجريبي ما يلي:
التحليل الكيميائي: قياس الرقم الهيدروجيني (pH)، الأحماض العضوية (حمض اللاكتيك، حمض الخليك، حمض البروبيونيك، حمض البوتيريك)، الكربوهيدرات الذائبة في الماء (WSC)، البروتين الخام (CP)، النيتروجين غير البروتيني (NPN)، ونيتروجين الأمونيا (NH3-N).
اختبار الاستقرار الهوائي: مراقبة درجة الحرارة على مدار 7 أيام لتحديد الوقت المطلوب لارتفاع درجة حرارة السيلاج بمقدار >2 درجة مئوية فوق درجة الحرارة المحيطة.
التحليل الميكروبي: تسلسل جين 16S rRNA (منطقة V3-V4) لتقييم بنية المجتمع البكتيري والتعاقب.
التحليل الميتاجينومي: تسلسل الميتاجينوم الكامل (Shotgun metagenomic sequencing) لتقييم الإمكانات الجينية الوظيفية (نماذج KEGG) المتعلقة باستقلاب الكربون والنيتروجين والفوسفور والكبريت.
التحليل الإحصائي: تحليل التباين (ANOVA) ثنائي الاتجاه وأحادي الاتجاه، تحليل ارتباط سبيرمان، وبناء شبكة ارتباط متكاملة تربط السمات الظاهرية، والأنواع، والنماذج الوظيفية.
النتائج الرئيسية
مسارات التخمير: أدى LP إلى تحمض مبكر سريع، مما أدى إلى سيطرة Lactiplantibacillus وتركيزات عالية من حمض اللاكتيك بحلول اليوم الثالث. في المقابل، أنتج BC تعاقباً "متدرجاً" يشمل أنواع Bacillus و Pediococcus و Lactiplantibacillus، مما أدى إلى انخفاض أبطأ في الرقم الهيدروجيني الأولي ولكن مع تراكم أعلى لحمض الخليك طوال فترة التخمير.
الحفاظ على النيتروجين: بعد 60 يوماً، أظهر السيلاج المعالج بـ BC أعلى محتوى من البروتين الخام (CP) وأدنى تركيزات من NPN و NH3-N، متفوقاً على كل من مجموعة الضبط ومعالجة LP. يشير هذا إلى أن BC كان أكثر فعالية في الحد من التحلل البروتيني في ظل ظروف البروتين العالي والـ WSC المنخفض المحددة.
الاستقرار الهوائي: أدت معالجات BC و BL إلى إطالة الاستقرار الهوائي بشكل كبير إلى 133.5 ساعة، مقارنة بـ 105 ساعات لـ LP و 40.5 ساعة لمجموعة الضبط. ومن الجدير بالذكر أن LP، رغم تحقيقه لأدنى رقم هيدروجيني مبكر، كان أقل استقراراً من BC عند التعرض للهواء.
الاستجابة الهوائية: عند التعرض للهواء، أظهرت مجموعة الضبط (CK) اضطراباً وظيفياً واسع النطاق وانجرافاً في المجتمع الميكروبي. حافظت LP و BL على بنية مستقرة نسبياً تهيمن عليها Lactiplantibacillus. أظهرت BC تعديلات وظيفية موضعية، حيث أثرت نماذج التنظيم والنقل (مثل أنظمة مكونين، وأنظمة نقل الفوسفات) بدلاً من التعرض لاضطراب واسع.
تحليل الشبكة: كشفت شبكة الارتباط المتكاملة أن سيطرة Lactiplantibacillus ارتبطت بالتحمض السريع، بينما ارتبطت الإمكانات الوظيفية المرتبطة بالأسيتات ونماذج استيعاب النيتروجين/الكبريت بالنمط الظاهري المرتبط بـ BC والمتمثل في الحفاظ على النيتروجين والاستقرار الهوائي.
المساهمات الرئيسية
تمييز آليات الملقحات: تميز الدراسة بين استراتيجية "السيادة السريعة" لبكتيريا حمض اللاكتيك متجانسة التخمير (LP) واستراتيجية "تعاقب المجتمع المتدرج" التي تقودها بكتيريا B. coagulans (BC). وتوضح أن هاتين الاستراتيجيتين تؤديان إلى مسارات تخمير ونتائج حفظ متباينة.
ربط التعاقب بالوظيفة: من خلال دمج الميتاجينوم الكامل مع البيانات الظاهرية، تربط الدراسة بين أنماط التعاقب الميكروبي المحددة (مثل الوجود المؤقت لـ Pediococcus وبقاء Bacillus) والإمكانات الوظيفية (إنتاج الأسيتات، والاحتفاظ بالنيتروجين/الكبريت) التي تدفع الحفاظ على النيتروجين والاستقرار الهوائي.
ملف الحمض مقابل عمق الرقم الهيدروجيني: تتحدى النتائج الافتراض القائل بأن أدنى رقم هيدروجيني مبكر هو المحدد الوحيد لجودة السيلاج. بدلاً من ذلك، تسلط الدراسة الضوء على أهمية ملف الأحماض العضوية النهائي (تحديداً تراكم حمض الخليك) واستمرارية الوظيفة الميكروبية عبر المراحل اللاهوائية والهوائية.
الرؤية الآلية للاستقرار الهوائي: تشير النتائج إلى أن الاستقرار الهوائي ليس مجرد وظيفة للتحمض المبكر، بل يعتمد على "الإرث اللاهوائي" – وتحديداً ملف الأحماض والاحتياطي الوظيفي الذي يتم إنشاؤه أثناء التخمير، مما يسمح بتعديلات مجتمعية موضعية بدلاً من الانهيار الشامل عند التعرض للأكسجين.
الأهمية والادعاءات يزعم المؤلفون أن أنماط التعاقب الميكروبي، وليس مجرد وجود سلالة ملقحة محددة، تعمل كمبدأ تصميمي لتحسين تخمير الكتلة الحيوية عالية البروتين. وتفترض الدراسة أن B. coagolans يعمل كملقح موجه نحو الاستقرار يسهل بناء مجتمع متدرج، مما يؤدي إلى نمط ظاهري يفضل إنتاج الأسيتات. ويرتبط هذا النمط بتميز الحفاظ على النيتروجين والاستقرار الهوائي الممتد مقارنة بملقحات حمض اللاكتيك التقليدية متجانسة التخمير.
تخلص الورقة إلى أنه بالنسبة للأعلاف عالية البروتين ومنخفضة الـ WSC مثل البرسيم الحجازي، فإن الحفظ الفعال يتطلب موازنة التحمض المبكر السريع مع الحفاظ على ملف الحمض في المراحل المتأخرة واستمرارية الوظيفة. ويُقدم الجمع بين LP و BC (BL) كاستراتيجية عملية تستفيد من التحمض المبكر لـ LP وآليات الاستقرار في المراحل المتأخرة لـ BC. ويشير المؤلفون بتواضع إلى أنه بينما تكشف بيانات الميتاجينوم عن الإمكانات الوظيفية، فإن المزيد من التحليلات المعتمدة على النسخ (transcriptomic) والتدفق (flux-based) مطلوبة لتأكيد مستويات التعبير الجيني والنشاط الإنزيمي. وتؤكد الدراسة أن الفوائد الملحوظة يُرجح أن تكون ناتجة عن التفاعل المعقد بين السلالة الملقحة والميكروبيوم الأصلي، وليس نتيجة نشاط الملقح وحده.