Bacillus coagulans inoculation generates an alternative microbial succession trajectory associated with nitrogen preservation and aerobic stability in alfalfa silage

技術要約：アルファルファサイレージにおける Bacillus coagulans の接種

問題提起
アルファルファ（Medicago sativa L.）は、極めて重要な高タンパク飼料作物であるが、高い緩衝能、低い水溶性炭水化物（WSC）濃度、および活発な植物プロテアーゼにより、サイレージ化において重大な課題を提示する。これらの特性は、酸性化の遅延、広範なタンパク質分解（窒素損失を招く）、およびサイロ開封時の好気的安定性の低下を引き起こすことが多い。Lactiplantibacillus plantarum のような乳酸菌（LAB）接種剤は、酸性化を加速させるために広く用いられているが、初期の急速なpH低下が必ずしも最適な窒素保持や好気的腐敗への耐性を保証するわけではない。さらに、Bacillus coagulans のような代替的な接種剤が、嫌気相および好気相の両方において、微生物の遷移、炭素の流れ、および窒素保持にどのように影響を与えるかという機能的メカニズムは、特にコミュニティ構造とメタゲノム機能ポテンシャルの関連性において、依然として十分に解明されていない。

方法論
本研究では、開花初期段階で収穫され、乾物重量（DM）約350 g/kgまで萎凋させたアルファルファを用いたラボスケールのバッグサイロ実験を採用した。以下の4つの処理を比較した：

1. CK: 無接種コントロール。
2. LP: Lactiplantibacillus plantarum MTD/1（$1 \times 10^6$ CFU/g FW）を接種。
3. BC: Bacillus coagulans（$1 \times 10^6$ CFU/g FW）を接種。
4. BL: LPとBCを併用接種（各 $5 \times 10^5$ CFU/g FW）。

サンプルは、3日目、15日目、60日目の嫌気性サイレージ期間中、および好気的曝露7日後の追加サンプリングにおいて採取された。実験デザインには以下が含まれる：

• 化学分析: pH、有機酸（乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸）、水溶性炭水化物（WSC）、粗タンパク質（CP）、非タンパク態窒素（NPN）、およびアンモニア態窒素（NH$_3$-N）の測定。
• 好気的安定性試験: サイレージ温度が周囲温度より2°C以上上昇するまでの時間を決定するために、7日間の温度モニタリングを実施。
• 微生物分析: 細菌コミュニティの構造と遷移を評価するための16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング（V3-V4領域）。
• メタゲノム解析: 炭素、窒素、リン、および硫黄の代謝に関連する機能遺伝子のポテンシャル（KEGGモジュール）を評価するためのショットガンメタゲノムシーケンシング。
• 統計解析: 二元および一元配置ANOVA、スピアマン相関分析、および表現型特性、分類群、機能モジュールを連結する統合的関連ネットワーク構築。

主な結果

• 発酵の軌跡: LPは急速な初期酸性化を誘導し、Lactiplantibacillus の優占と3日目における高濃度の乳酸形成を確立した。対照的に、BCはBacillus、Pediococcus、およびLactiplantibacillus 分類群を含む「段階的」な遷移を生成し、その結果、初期のpH低下は緩やかであったが、サイレージ期間を通じて高い酢酸蓄積をもたらした。
• 窒素保持: 60日後、BC処理されたサイレージは最も高い粗タンパク質（CP）含有量と、最も低いNPNおよびNH$_3$-N濃度を示し、コントロールおよびLP処理を上回った。これは、特定の高タンパク・低WSC条件下において、BCがタンパク質分解を制限する上でより効果的であったことを示唆している。
• 好気的安定性: BCおよびBL処理は、好気的安定性をLPの105時間に対し133.5時間まで有意に延長させた。注目すべきは、LPは初期pHこそ最も低かったものの、空気への曝露時にはBCよりも安定性が低かった点である。
• メタゲノムによる洞察:
  • BCの軌跡: 酢酸関連の機能モジュール（例：酢酸キナーゼ/ホスホトランスアセチラーゼ経路）の持続的な濃縮、および嫌気性発酵中の窒素および硫黄同化モジュールの保持に関連していた。
  • 好気的応答: 好気的曝露時、コントロール（CK）は広範な機能的攪乱とコミュニティのドリフトを示した。LPおよびBLは、比較的安定したLactiplantibacillus 優占構造を維持した。BCは、広範な崩壊を経験するのではなく、調節および輸送関連のモジュール（例：二成分制御系、ホスホトランスフェラーゼシステム）を濃縮するという、局所的な機能調整を示した。
• ネットワーク解析: 統合的関連ネットワークにより、Lactiplantibacillus の優占は急速な酸性化と相関し、一方で酢酸関連の機能ポテンシャルおよび窒素/硫黄同化モジュールは、窒素保持と好気的安定性というBCに関連する表現型と結びついていた。

主な貢献

1. 接種剤メカニズムの差別化: 本研究は、ホモ乳酸発酵型LAB（LP）による「急速な優占」戦略と、B. coagulans（BC）によって駆動される「段階的なコミュニティ遷移」戦略を区別している。これらが異なる発酵プロファイルと保存結果をもたらすことを実証した。
2. 遷移と機能の連結: ショットガンメタゲノミクスを表現型データと統合することで、特定の微生物遷移パターン（例：Pediococcus の一過的な存在とBacillus の保持）を、窒素保持および好食的安定性を駆動する機能ポテンシャル（酢酸生成、窒素/硫黄同化）へと結びつけた。
3. 酸プロファイル vs pHの深さ: 最も低い初期pHがサイレージ品質の唯一の決定要因であるという仮定に疑問を投げかけている。むしろ、本研究は、最終的な有機酸プロファイル（特に酢酸の蓄積）と、嫌気相および好気相にわたる微生物機能の連続性の重要性を強調している。
4. 好気的安定性へのメカニズム的洞察: 好気的安定性は単に初期の酸性化の関数ではなく、酸素曝露時に広範な崩壊ではなく局所的なコミュニティ調整を可能にする「嫌気的な遺産（anaerobic legacy）」、具体的には、発酵中に確立された酸プロファイルと機能的リザーバーに依存していることを示唆している。

意義と主張
著者らは、特定の接種菌株の存在だけでなく、微生物の遷移パターンこそが、高タンパク質バイオマスの発酵を改善するための設計原理として機能すると主張している。本研究は、B. coagulans が、段階的なコミュニティ形成を促進する「安定性志向」の接種剤として機能し、酢酸を好む発酵表現型をもたらすと断定している。この表現型は、従来のホモ乳酸発酵型LAB接種剤と比較して、優れた窒素保持と長期の好気的安定性と関連している。

結論として、アルファルファのような高タンパク・低WSCの飼料においては、効果的な保存には、初期の急速な酸性化と、後期段階の酸プロファイル維持とのバランスが必要であるとしている。LPとBCの組み合わせ（BL）は、LPによる初期酸性化とBCによる後期安定性メカニズムを併せ持つ実用的な戦略として提示されている。著者らは、メタゲノムデータは機能的「ポテンシャル」を示すものであり、遺伝子発現や酵素活性レベルを確認するには、さらなるトランスクリプトーム解析やフラックス解析が必要であると控えめに述べている。本研究は、観察された利益が、接種菌単独の活動ではなく、接種菌と土着のマイクロバイオームとの間の複雑な相互作用によって媒介されていることを強調している。