Several aspects of poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles surface modification via a layer-by-layer method
تتقصى هذه الورقة البحثية التعديل السطحي لجسيمات البوليمر (PLGA) النانوية بطبقة تلو الأخرى، مع تسليط الضوء على ضرورة التثبيت الفراغي الأولي وتحليل كيفية تأثير نسب البوليمرات الإلكتروليتية، والأوزان الجزيئية، وتوليفات بوليمرية محددة على الخصائص الفيزيائية والكيميائية الناتجة لأنظمة التوصيل متعددة الوظائف.
تخيل عالماً يمكن فيه لكبسولات حيوية دقيقة، قابلة للتحلل، أن توصل الدواء مباشرة إلى خلية مريضة، وتطلق حمولتها فقط عند الحاجة وفي المكان المطلوب. هذا هو الوعد الذي تقدمه الجسيمات النانوية البوليمرية، وهي حاملات مجهرية مصنوعة من مواد يمكن للجسم تفكيكها بأمان. ومن بين أكثر هذه الحاملات واعداً هي مادة تسمى "PLGA"، وهي بوليمر يشبه البلاستيك يمكن تشكيله في هيئة كرات صغيرة بما يكفي للسفر عبر مجرى الدم. ومع ذلك، لكي تكون هذه الكرات مفيدة حقاً كمركبات لتوصيل الدواء، يجب على العلماء أن يتمكنوا من تغليفها بجلد واقٍ ووظيفي. هذا الجلد، الذي يُبنى طبقة تلو الأخرى، يمكنه التحكم في سرعة إطلاق الدواء، أو إخفاء الجسيم عن الجهاز المناعي، أو المساعدة في العثัง على هدفه. ويكمن التحدي في تطبيق هذا الجلد دون التسبب في تكتل الكرات الصغيرة مع بعضها البعض لتصبح كتلًا عديمة الفائدة، أو نموها لدرجة تجعلها غير قادرة على التنقل عبر مسارات الجسم الضيقة.
في دراسة حديثة، عالج باحثون في معهد كورتشاتوف في موسكو مشكلة محددة تتعلق بكيفية تطبيق هذا الجلد الواقي بنجاح على جسيمات PLGA النانوية. فقد ركزوا على تقنية تسمى "التجميع طبقة تلو أخرى"، حيث تنجذب الجزيئات ذات الشحنات المتضادة إلى سطح الجسيم مثل المغناطيس، لتبني غلافاً طبقة تلو أخرى. واكتشف الفريق أن نجاح هذه العملية يعتمد كلياً على كيفية تحضير الجسيمات قبل بدء عملية التغليف. ووجدوا أنه إذا تُركت الجسيمات النانوية في حالتها الخام غير المغلفة، فإنه في اللحظة التي تحاول فيها جذب الطبقة الأولى من مادة التغليف، تفقد الجسيمات استقرارها. وبدلاً من قبول طبقة رقيقة ومرتبة، تصطدم ببعضها البعض، مكونة كتلًا كبيرة وغير منتظمة، أكبر وأكثر فوضوية مما ينبغي لتكون مفيدة. وكان الحل، كما وجدوا، هو تغليف الجسيمات النانوية أولاً بدرع رقيق وغير مرئي من مادة تسمى "كحول البولي فينيل". تعمل هذه الخطوة التمهيدية كحاجز، مما يحافظ على تباعد الجسيمات واستقرارها في الماء، وهو ما يسمح لطبقات التغليف اللاحقة بالالتصاق بسلاسة وتساوٍ دون التسبب في تصادم.
بمجرد استقرار الجسيمات بشكل صحيح بهذا الدرع الأولي، اختبر الباحثون كيف تؤثر عوامل مختلفة على النتيجة النهائية. فقد قاموا بتغيير كمية مادة التغليف المضافة، وحجم جزيئات التغليف، وحتى نوع المادة المستخدمة، بما في ذلك كل من المواد الكيميائية الاصطناعية والسلاسل الطبيعية الشبيهة بالبروتين. ووجدوا أنه بمجرد وجود مادة تغليف كافية لتغطية السطح بالكامل، فإن إضافة المزيد لا يغير حجم أو استقرار الجسيمات؛ بل ببساطة يصبح السطح مشبعاً، ويُغسل الجزء الزائد. ومع ذلك، كان حجم جزيئات التغليف مهماً بشكل كبير. فعندما استخدموا جزيئات ضخمة ذات سلاسل طويلة للطبقة الثانية من الغلاف، نمت الجسيمات بشكل ملحوظ، حيث انتفخت لتصل إلى ضعف حجمها الأصلي تقريباً. ويرى الباحثون أن هذا حدث لأن هذه السلاسل الطويلة حبست الماء وتمددت، مما خلق غلافاً أكثر رخاوة وضخامة. وفي المقابل، حافظ استخدام الجزيئات الأصغر على غلاف مدمج.
ولعل الأهم من ذلك، هو أن الفريق أثبت إمكانية بناء غلاف متعدد الطبقات باستخدام مزيج من المواد الاصطناعية والببتيدات المتعددة (polypeptides)، وهي سلاسل من الأحماض الأمينية تشبه تلك الموجودة في الجسم. سمح هذا النهج لهم ببناء هيكل متطور متعدد الطبقات دون التسبب في تكتل الجسيمات أو نموها بشكل زائد. وظلت الجسيمات المغلفة النهائية صغيرة نسبياً، حيث بلغ قطرها حوالي 240 نانومتر بعد طبقة التغليف الأولى، وحافظت على توزيع حجم موحد، وهو أمر بالغ الأهمية للتطبيقات الطبية. ومع ذلك، أشارت الدراسة إلى أنه عند استخدام تركيبات محددة ذات وزن جزيئي مرتفع، يمكن أن يزدትاد الحجم بشكل كبير ليصل إلى حوالي 400 نانومتر، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى اختيار المواد بعناية لإبقاء الجسيمات ضمن نطاق الحجم المفضل. وتخلص الدراسة إلى أنه بينما تعد طريقة "الطبقة تلو الأخرى" قوية، إلا أنها تتطلب أساساً دقيقاً. فمن خلال تثبيت الجسيمات النانوية أولاً بطبقة واقية، يمكن للعلماء بناء جلود معقدة ووظيفية بنجاح على هذه الحاملات الدقيقة، مما يمهد الطريق لأنظمة توصيل دواء أكثر دقة وفعالية يمكنها التنقل في جسم الإنسان بسهولة.
ملخص تقني: جوانب تعديل سطح جسيمات البولي (دي، إل-لاكتيد-كو-جليكوليد) النانوية عبر طريقة الطبقة تلو الأخرى
بيان المشكلة بينما تُعد عملية امتزاز البوليات الإلكتروليتية ذات الشحنات المتضادة بطريقة الطبقة تلو الأخرى (LbL) استراتيجية معترف بها لإنشاء أنظمة توصيل أدوية متعددة الوظائف تعتمد على البوليسترات القابلة للتحلل الحيوي مثل بولي (دي، إل-لاكتيد-كو-جليكوليد) (PLGA)، إلا أن التأثير المحدد لمعايير التعديل على الخصائص الفيزيائية الكيميائية لجسيمات PLGA النانوية لا يزال غير مدروس بشكل كافٍ. وتتمثل إحدى التحديات الحرجة المحددة في استقرار جسيمات PLGA النانوية أثناء الامتزاز الأولي للطبقة الأولى من البوليات الإلكتروليتية. وعلى الرغم من أن جسيمات PLGA النانوية تمتلك عادةً جهداً إلكتروكينتيكياً سالباً في الأوساط المائية، إلا أن إضافة الأملاح (المطلوبة غالباً لمحاليل البوليات الإلكتروليتية) يمكن أن تؤدي إلى التجمع، لا سيما في الجسيمات التي تفتقر إلى الاستقرار الفراغي. علاوة على ذلك، هناك نقص في البيانات المنهجية المتعلقة بكيفية تأثير تركيز البوليات الإلكتروليتية، والوزن الجزيئي لها، واستخدام الببتيدات المتعددة مقابل البوليمرات الاصطناعية على القطر الهيدروديناميكي النهائي، ومؤشر التشتت المتعدد (PDI)، وجهد زيتا (zeta potential) للجسيمات النانوية المعدلة. إن الحفاظ على حجم الجسيمات دون 500 نانومتر أمر ضروري للتطبيقات الطبية، مما يستلزم بروتوكول تعديل يمنع التلبد بين الجسيمات مع تجنب النمو المفرط في الحجم.
المنهجية استخدمت الدراسة جسيمات PLGA نانوية (بنسبة 75/25 مول% من اللاكتيد/الجليكوليد) تم تصنيعها عبر بلمرة فتح الحلقة وتحضيرها عن طريق الترسيب النانوي. تم إنشاء نوعين رئيسيين من القوالب:
جسيمات PLGA غير المغلفة: حُضرت بدون أي عامل تثبيت.
جسيمات PLGA المثبتة بـ PVA: حُضرت باستخدام كحول البولي فينيل (PVA) ثم نُقيت عبر الطرد المركزي الفائق لإزالة الـ PVA الحر.
أُجري تعديل LbL عن طريق التناوب في امتزاز البوليات الإلكتروليتية ذات الشحنات المتضادة. استقصى التصميم التجريبي ثلاثة متغيرات محددة:
التثبيت الأولي: مقارنة نجاح تعديل LB على قوالب غير مغلفة مقابل قوالب مثبتة بـ PVA باستخدام البوليكاتيون دي إيثيل أمينو إيثيل ديكستران (DEAED).
تركيز البوليات الإلكتروليتية: تغيير نسبة الوزن لجسيمات PLGA المثبتة بـ PVA إلى DEAED (2:1، 1:1، و1:2) لتحديد تأثير فائض البوليكاتيون على خصائص الجسيمات.
الوزن الجزيئي للبوليات الإلكتروليتية: تغليف جسيمات PLGA/DEAED بملح صوديوم ديكستران سلفات (Na-DS) بوزنين جزيئيين مختلفين (5 كيلو دالتون و500 كيلو دالتون) لتقييم تأثير طول السلسلة على سمك الطبقة والاستقرار.
نوع البوليمر: درسة مقارنة باستخدام مزيج من البوليكاتيون الاصطناعي بولي إيثيلين إيمين (PEI) والببتيد متعدد الببتيد صوديوم ملح حمض البولي (إل-جلوتاميك) (PGA) لتقييم تكوين هياكل متعددة الطبقات.
أُجري التوصيف باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) للقطر الهيدروديناميكي (Dh) ومؤشر التشتت المتعدد (PDI)، وتشتت الضوء الكهربائي (EPLS) للجهد الإلكتروكينتيكي (ζ-potential).
النتائج الرئيسية
ضرورة الاستقرار الفراغي: وُجد أن الاستقرار الفراغي الأولي باستخدام PVA هو شرط مسبق لنجاح تعديل LbL. فقد تجمعت جسيمات PLGA غير المغلفة بشكل كبير عند إضافة محلول DEAED (الذي يحتوي على 0.2 مولار NaCl)، مما أدى إلى زيادة كبيرة في Dh (من ~160 نانومتر إلى ~560 نانومتر) وتشتت متعدد عالٍ (PDI 0.32 ± 0.05). في المقابل، خضعت الجسيمات المثبتة بـ PVA لعملية عكس الشحنة بنجاح عند امتزاز DEAED. وبينما ارتفعت قيمة PDI من 0.04 ± 0.02 إلى 0.09 ± 0.02 (زيادة قدرها 2.25 ضعف)، حافظت الجسيمات على توزيع حجم ضيق (Dh≈220 نانومتر) مقارنة بالجسيمات غير المغلفة. فقد وفرت طبقة PVA تنافراً فراغياً منع التجمع رغم انضغاط الطبقة المزدوجة الكهربائية الناتج عن الملح.
تأثير تركيز البوليكاتيون: لم يؤدِ تغيير نسبة الوزن لـ PLGA NPs إلى DEAED (2:1، 1:1، 1:2) إلى تغيير ملموس في Dh أو PDI أو جهد ζ للجسيمات المعدلة. في جميع الحالات، كان البوليكاتيون في حالة فائض بالنسبة للمتطلب أحادي الطبقة النظري، مما أدى إلى تشبع السطح. وبناءً على ذلك، استقر جهد ζ عند حد معين، مما يشير إلى أن التغطية السطحية كانت كاملة بغض النظر عن النسبة المحددة ضمن النطاق المختبر.
تأثير الوزن الجزيئي للبولي أنيون: أثر الوزن الجزيئي للبولي أنيون (Na-DS) بشكل كبير على خصائص الجسيمات النهائية. أدى امتزاز Na-DS عالي الوزن الجزيئي (500 كيلو دالتون) إلى قطر هيدروديناميكي أكبر (~400 نانومتر) مقارنة بـ Na-DS منخفض الوزن الجزيئي (5 كيلو دالتون). ويعزو المؤلفون الحجم الأكبر لجسيمات Na-DS500 إلى تكوين طبقة أكثر رخاوة وانتفاخاً تحتوي على المزيد من الأيونات المقابلة المحتجزة، بدلاً من التلبد الناتج عن "التجسير"، كما يتضح من انخفاض PDI (0.11) وارتفاع جهد ζ المطلق (-48 ميلي فولت). وعلى العكس من ذلك، شكل Na-DS5 طبقة أكثر كثافة مع زيادة أصغر في الحجم ولكن مع جهد ζ مطلق أقل (-26 ميلي فولت).
الببتيد متعدد الببتيد مقابل البوليمر الاصطناعي: سمح الجمع بين PEI الاصطناعي وPGA الببتيدي ببناء هياكل متعددة الطبقات. أدى امتزاز PEI إلى زيادة حجم الجسيمات بمقدار 40 نانومتر لكل طبقة، بينما أدى امتزاز PGA إلى زيادة أصغر (10 نانومتر). وقد عُزي هذا الاختلاف إلى إعادة التنظيم والتغيرات التشكيلية لسلاسل ببتيد PGA على السطح. وقد حافظ الامتزاز المتتابع لـ PEI وPGA على PDI منخفض (< 0.3) وأبقى حجم الجسيمات النهائي ضمن النطاق المفضل للتطبيقات الطبية الحيوية.
الأهمية والادعاءات يزعم البحث تقديم دراسة منهجية لمعايير تعديل LbL لجسيمات PLGA النانوية تحديداً، معالجةً فجوة في الأدبيات حيث لا يتم توصيف هذه المعايير بشكل كافٍ. وتتمثل المساهمة الأساسية في إثبات أن الاستقرار الفراغي الأولي (مثل PVA) ضروري لنجاح تعديل LbL لجسيمات PLG النانوية في الظروف الملحية، مما يمنع التجمع الذي يحدث مع القوالب غير المغلفة.
تثبت الدراسة ما يلي:
بمجرد ضمان الاستقرار الفراغي، فإن نسبة الوزن الدقيقة للبوليكاتيون إلى الجسيمات النانوية (ضمن نطاق الفائض) لا تغير بشكل حرج الحجم النهائي للجسيمات أو شحنتها، حيث يحدث تشبع للسطح.
يعد الوزن الجزيئي للبوليات الإلكتروليتية معيار ضبط حرجاً؛ إذ يمكن للبوليمرات عالية الوزن الجزيئي أن تخلق طبقات أكثر سمكاً ورخاوة مع كثافة شحنة سطحية أعلى، ولكن مع زيادة كبيرة في الحجم الإجمالي للجسيمات، مما قد يحد من فائدتها الطبية الحيوية إذا تجاوزت عتبة 500 نانومتر.
يوفر الجمع بين البوليات الإلكتروليتية الاصطناعية والببتيدات متعددة الببتيد (PEI/PGA) استراتيجية قابلة للتطبيق لبناء هياكل متعددة الطبقات دون زيادة كبيرة في التشتت المتعدد أو حجم الجسيمات، مما يدعم إمكانية إنشاء حاملات متعددة الوظائف للتوصيل المستهدف.
يخلص المؤلفون إلى أن هذه النتائج حاسمة للتصميم العقلاني لأنظمة التوصيل القائمة على PLGA، مما يضمن أن عملية التعديل تنتج جسيمات نانوية مستقرة ومتجانسة مناسبة للتطبيقات داخل الجسم الحي.