A novel strategy for enhancing anthocyanins content in VdMYB56-overexpressing rabbiteyes blueberry lines

تُحتفى بالتوت الأزرق كغذاء خارق، ليس فقط لمذاقه الحلو، بل لمجموعته الكثيفة من العناصر الغذائية، ولا سيما مجموعة من الأصباغ تسمى الأنثوسيانين. هذه المركبات هي التي تمنح الثمرة ألوانها الزرقاء والأرجوانية العميقة، وهي مرتبطة بفوائد صحية كبيرة. وبالنسبة لعلماء النبات، يمثل التوت الأزرق تحديًا مثيرًا للاهتمام؛ فبينما يفهمون التعليمات الجينية التي تخبر النبات بكيفية صنع هذه الأصباغ الملونة، فإن تغيير الحمض النووي لنبات التوت الأزدي لإنتاج المزيد منها كان أمرًا صعبًا للغاية. وخلافًا لبعض المحاصيل التي تقبل المواد الجينية الجديدة بسهولة في المختبر، فإن نباتات التوت الأزرق عنيدة؛ إذ غالبًا ما تقاوم خلاياها الطرق القياسية المستخدمة لإدخال جينات جديدة، وحتى عندما تقبلها، تعاني النباتات في النمو مجددًا لتصبح عينات صحية ومثمرة. وقد أدى هذا الاختناق إلى إبطاء تطوير أصناف جديدة من التوت الأزرق تكون أغنى بمضادات الأكسدة أو ذات ألوان مختلفة.

لقد نجح فريق من الباحثين في جامعة غويتشو الآن في تجاوز عقبة رئيسية في هذه العملية. فقد نجحوا في بناء طريقة موثوقة لإدخال جين محدد في نباتات التوت الأزرق من نوع "رابت آي" (rabbiteye)، وهو صنف شائع يُزرع في جنوب شرق الولايات المتحدة. ومن خلال استخدام بكتيريا تربة طبيعية كوسيلة نقل، تمكنوا من تشغيل مفتاح جيني يزيد بشكل كبير من إنتاج الأنثوسيانين. وكانت النتيجة عبارة عن مجموعة جديدة من خطوط التوت الأزرق التي تبدو أكثر احمرارًا وتحتوي على مستويات أعلى بكثير من هذه الأصباغ المفيدة مقارنة بنظيراتها البرية. إن هذا العمل لا يقتصر فقط على إنشاء نبات ملون؛ بل يوفر مخطط عمل لكيفية تحسين التوت الأزرق وراثيًا، مما يفتح الباب أمام برامج التربية التي يمكنها تعزيز القيمة الغذائية للتوت الأزرق في المستقبل.

تبدأ القصة بنبات التوت الأزرق نفسه، وتحديدًا صنف يُعرف باسم "برايتويل" (Brightwell). في المختبر، بدأ الباحثون بقطع صغيرة وعقيمة من أوراق الشتلات المستزرعة نسيجيًا. كانت مهمتهم الأولى هي إقناع خلايا هذه الأوراق بالتوقف عن كونها أوراقًا والبدء في التصرف ككتلة من الخلايا غير المتمايزة، المعروفة باسم "الكالوس" (callus)، والتي يمكن لاحقًا توجيهها لتنمو لتصبح نباتًا كاملاً. هذه الخطوة حاسمة لأن الخلايا يجب أن تكون في حالة محددة ومستقبلة لتقبل التعليمات الجينية الجديدة. ووجد الفريق أن مزيجًا دقيقًا من هرمونات النبات كان ضروريًا لهذا التحول؛ فمن خلال معالجة قطع الأوراق بمزيج من منظم نمو يسمى "ثيديازورون" (thidiazuron) وكمية صغيرة من هرمون آخر يسمى "إندول-3-أسيتيك أسيد" (indole-3-acetic acid)، تمكنوا من تحفيز معدل مرتفع لتكوين الكالوس. كانت هذه النموات الجديدة ناعمة وصفراء ورخوة، وهو ملمس أثبت أنه مثالي للمرحلة التالية من التجربة.

بمجرد حصولهم على إمداد صحي من هذه الخلايا المستقبلة، استعد الباحثون لتوصيل الجين الجديد. لقد اختاروا جينًا يسمى VdMYB56، والذي أشارت دراسات سابقة إلى أنه يعمل كمنظم رئيسي لإنتاج الأنثوسيانين. ولإدخال هذا الجين إلى خلايا التوت الأزرق، استخدموا بكتيريا تسمى "أجروباكتيريوم توميفاسيانز" (Agrobacterium tumefaciens). هذه البكتيريا هي مهندس جيني طبيعي؛ ففي البرية، تصيب النباتات وتنقل حمضها النووي الخاص إليها. وقد سخر العلماء هذه القدرة، باستبدال الحمض النووي الضار للبكتيريا بالجين المفيد الذي يرغبون في دراسته. قام الباحثون بزراعة البكتيريا في مزرعة سائلة حتى وصلت إلى كثافة معينة، ثم خلطوا البكتيريا مع كالوس التوت الأزرق.

اعتمد نجاح هذه العدوى بشكل كبير على التوقيت. اختبر الفريق ظروفًا متنوعة للعثور على "النقطة المثالية" حيث يمكن للبكتيريا نقل الجين دون قتل خلايا النبات الرقيقة. واكتشفوا أن غمس الكالوس في المحلول البكتيري لمدة عشر دقائق بالضبط كان المدة المثالية. فإذا كانت فترة التعرض قصيرة جدًا، تفشل البكتيريا في إيصال الجين، وإذا كانت طويلة جدًا، تتضرر خلايا النبات وتموت. بعد هذه العدوى القصيرة، وُضع الكالوس في بيئة مظلمة لمدة ثلاثة أيام للسماح للتحويل الجيني بالترسخ. بعد ذلك، نُقلت الخلايا إلى وسط نمو خاص يحتوي على مضادات حيوية. كانت هذه المضادات الحيوية تخدم غرضًا مزدوجًا: فهي تقتل البكتيريا المتبقية، والأهم من ذلك، تقتل أي خلايا توت أزرق فشلت في قبول الجين الجديد. فقط الخلايا التي دمجت بنجاح جين VdMYB56 امتلكت علامة مقاومة سمحت لها بالبقاء على قيد الحياة بعد المعالجة بالمضادات الحيوية.

كانت نتائج عملية الفرز هذه مذهلة. حقق الباحثون كفاءة تحول تقترب من أحد عشر بالمائة، مما يعني أنه من بين كل مائة خلية عولجت، نجحت حوالي إحدى عشرة خلية في دمج الجين الجديد والبقاء على قيد الحياة خلال عملية الاختيار. وهذا إنجاز كبير لمحصول معروف بصعوبة تعديله وراثيًا. ومع نمو الخلايا الناجية، حدث تغير مرئي؛ فبينما ظلت خلايا التوت الأزرق البرية غير المعالجة صفراء باهتة، بدأت الخلايا المعدلة وراثيًا تتحول إلى اللون الأحمر الداكن والنابض بالحياة. كان هذا التغير في اللون هو أول علامة فيزيائية على أن جين VdMYB56 يعمل كما هو مخطط له، مما يحفز إنتاج الأنثوسيانين.

ولتأكيد ما يحدث داخل هذه الخلايا الحمراء، قام الباحثون بقياس مستويات الجين الجديد والإنزيمات التي يتحكم فيها. ووجدوا أن جين VdMYB56 كان موجودًا في الخلايا المعدلة بمستويات أعلى بكثير مما هو عليه في النوع البري. والأهم من ذلك، أن هذه الزيادة في الجين الرئيسي تسببت في تأثير متسلسل، مما عزز نشاط إنزيم لاحق يسمى Vd3GT، وهو المسؤول مباشرة عن استقرار أصباغ الأنثوسيانين. كان إجمالي كمية الأنثوسيانين في الكالوس المعدل أعلى بما يصل إلى 3.56 مرة مقارنة بالنباتات غير المعدلة. كما كان نشاط الإنزيم المسؤول عن إضافة جزيئات السكر إلى الصبغة، والذي يساعد في الحفاظ على استقرار اللون، أعلى بأكثر من أربع مرات في الخطوط المعدلة.

تمثلت الخطوة الأخيرة في تحويل هذه الكتل الخلوية الحملة المعدلة وراثيًا إلى هياكل نباتية جديدة. وضع الباحثون الكالوس الأحمر في وسط نمو جديد مصمم لتشجيع تكوين براعم صغيرة، تُعرف بالبراعم الإضافية (adventitious buds). واستخدموا مزيجًا محددًا من الهرمونات، بما في ذلك "ثيديازورون" و"نافثالين حمض الأسيتيك" (naphthaleneacetic acid)، لتوجيه هذا التطور. وكانت النتيجة مجموعة من خطوط براعم التوت الأزرق الإضافية الجديدة التي نمت من الخلايا المعدلة. حافظت هذه الخطوط الجديدة، التي أطلق عليها الباحثون اسم خطوط "VdMYB5overexpressing"، على اللون الأحمر الذي شوهد في مرحلة الكالوس. وعندما حللوا هذه الخطوط الجديدة، أكدت البيانات النتائج السابقة؛ حيث كان تعبير جين VdMYB56 في البراعم الجديدة يتراوح بين ضعفين وأربعة وعشرين ضعفًا مقارنة بنباتات التوت الأزرق العادية. وبناءً على ذلك، كان مستوى إنزيم Vd3GT أيضًا مرتفعًا بشكل ملحوظ، حيث تراوح بين عشرة إلى عشرين ضعفًا مقارنة بالنوع البري.

كانت الأدلة الفيزيائية لا تقبل الجدل. فقد أنتجت خطوط التوت الأزرق الجديدة براعم إضافية حمراء مميزة، في تباين صارخ مع البراعم الخضراء للنباتات البرية التي نمت تحت نفس الظروف. وكان إجمالي محتوى الأنثوسيانين في هذه الخطوط الحمراء أعلى بما يصل إلى 4.52 مرة من نباتات التحكم. علاوة على ذلك، كان النشاط الإنزيمي المسؤول عن إنتاج هذه الأصباغ أعلى باستمرار في جميع الخطوط الناجحة. حدد الباحثون خمسة خطوط متميزة أظهرت باستمرار هذه السمات المعززة، مما أكد أن التعديل الجيني كان مستقرًا وقابلًا للتوريث في الأنسجة النباتية الجديدة.

يُظهر هذا العمل أن الحاجز أمام تحسين التوت الأزرق من خلال الهندسة الوراثية ليس مستحيلاً. فمن خلال تحسين ظروف نمو الخلايا، والعدوى البكتيرية، والاختيار بالمضادات الحيوية بعناية، نجح الفريق في إنشاء نظام موثوق لإدخال سمات جديدة في التوت الأزرق من نوع "رابت آي". ويشير نجاح جين VdMYB56 في تعزيز مستويات الأنثوسيانين إلى أن هذا النهج يمكن استخدامه لإنشاء أصناف جديدة من التوت الأزرق ليست ملونة فحسب، بل هي أيضًا أغنى بالمركبات المفيدة للصحة التي تجعل هذه الثمرة قيمة للغاية. توفر الدراسة طريقة ملموسة لمربي النباتات لإنشاء أصول وراثية جديدة، مما يوفر مسارًا لتطوير توت أزرق بملفات تعريف غذائية معززة دون الاعتماد على طرق التهجين التقليدية التي تستغرق وقتًا طويلاً. إن البراعم الحمراء الواقفة في المختبر ليست مجرد فضول بصري؛ بل هي الدليل الملموس على إمكانية فتح الإمكانات الجينية لهذه الثمرة وتوجيهها نحو نتائج محددة ومفيدة.