A novel strategy for enhancing anthocyanins content in VdMYB56-overexpressing rabbiteyes blueberry lines

ब्लूबेरी को एक सुपरफूड के रूप में मनाया जाता है, जो न केवल अपने मीठे स्वाद के लिए बल्कि पोषक तत्वों के सघन संग्रह, विशेष रूप से एंथोसायनिन नामक पिगमेंट के समूह के लिए भी प्रसिद्ध है। ये यौगिक फल को इसके गहरे नीले और बैंगनी रंग प्रदान करते हैं और महत्वपूर्ण स्वास्थ्य लाभों से जुड़े हैं। वनस्पति वैज्ञानिकों के लिए, ब्लूबेरी एक दिलचस्प चुनौती का प्रतिनिधित्व करती है। हालांकि वे उन आनुवंशिक निर्देशों को समझते हैं जो एक पौधे को इन रंगीन पिगमेंट बनाने के लिए बताते हैं, वास्तव में अधिक उत्पादन के लिए ब्लूबेरी के डीएनए को बदलना बेहद कठिन रहा है। कुछ फसलों के विपरीत जो प्रयोगशाला में नए आनुवंशिक पदार्थ को आसानी से स्वीकार कर लेती हैं, ब्लूबेरी जिद्दी होती है। उनकी कोशिकाएं अक्सर नए जीन पेश करने के मानक तरीकों का विरोध करती हैं, और भले ही वे उन्हें स्वीकार कर लें, फिर भी पौधों को स्वस्थ, फल देने वाले नमूनों के रूप में वापस बढ़ने में संघर्ष करना पड़ता है। इस बाधा ने अधिक एंटीऑक्सीडेंट वाले या अलग रंगों वाले नए ब्लूबेरी किस्मों के विकास को धीमा कर दिया है।

ग्वीझोउ विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब इस प्रक्रिया में एक बड़ी बाधा को दूर कर दिया है। उन्होंने रैबिटआई ब्लूबेरी (एक लोकप्रिय किस्म जिसे दक्षिण-पूर्वी संयुक्त राज्य अमेरिका में उगाया जाता है) में एक विशिष्ट जीन डालने के लिए एक विश्वसनीय विधि सफलतापूर्वक बनाई है। एक प्राकृतिक मिट्टी के बैक्टीरिया को वितरण वाहन के रूप में उपयोग करके, वे एक आनुवंशिक स्विच को चालू करने में सफल रहे जो एंथोसायनिन के उत्पादन को नाटकीय रूप से बढ़ाता है। परिणाम स्वरूप, ब्लूबेरी की नई लाइनों का एक सेट प्राप्त हुआ जो दृश्य रूप से अधिक लाल है और अपने जंगली समकक्षों की तुलना में इन लाभकारी पिगमेंट के काफी उच्च स्तरों से युक्त है। यह कार्य केवल एक रंगीन पौधा बनाने से कहीं अधिक है; यह इस कठिन फसल को आनुवंशिक रूप से सुधारने के तरीके के लिए एक कार्यशील ब्लूप्रिंट प्रदान करता है, जो भविष्य के लिए ब्लूबेरी के पोषण मूल्य को बढ़ाने वाले प्रजनन कार्यक्रमों के द्वार खोलता है।

यह कहानी स्वयं ब्लूबेरी के पौधे से शुरू होती है, विशेष रूप से 'ब्राइटवेल' नामक एक किस्म से। प्रयोगशाला में, शोधकर्ताओं ने ऊतक-संवर्धित (टिश्यू-कल्चर) पौधों से पत्तियों के छोटे, बाँझ टुकड़ों से शुरुआत की। उनका पहला कार्य इन पत्ती की कोशिकाओं को यह विश्वास दिलाना था कि वे पत्तियाँ बनना बंद कर दें और अनिश्चित कोशिकाओं (undifferentiated cells) के एक द्रव्यमान के रूप में कार्य करना शुरू करें, जिसे कैलस (callus) कहा जाता है, जो अंततः एक पूरे नए पौधे के रूप में विकसित होने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। यह चरण महत्वपूर्ण है क्योंकि कोशिकाओं को नए आनुवंशिक निर्देशों को स्वीकार करने के लिए एक विशिष्ट, ग्रहणशील अवस्था में होना चाहिए। टीम ने पाया कि इस परिवर्तन के लिए पादप हार्मोन का एक सटीक मिश्रण आवश्यक था। इन पत्ती के टुकड़ों को थिडियाज़ुरोन (thidiazuron) नामक एक विकास नियामक और इंडोल-3-एसिटिक एसिड (indole-3-acetic acid) नामक एक अन्य हार्मोन की थोड़ी मात्रा के संयोजन के साथ उपचारित करके, वे कैलस निर्माण की उच्च दर को प्रेरित करने में सक्षम थे। ये नई वृद्धि कोमल, पीली और ढीली थी, जिसका बनावट अगले चरण के लिए आदर्श साबित हुई।

एक बार जब उनके पास इन ग्रहणशील कोशिकाओं की स्वस्थ आपूर्ति हो गई, तो शोधकर्ताओं ने नए जीन को वितरित करने की तैयारी की। उन्होंने VdMYB56 नामक जीन को चुना, जिसे पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया था कि एंथोसायनिन उत्पादन के लिए एक मास्टर रेगुलेटर के रूप में कार्य करता है। इस जीन को ब्लूबेरी कोशिकाओं में पहुँचाने के लिए, उन्होंने Agrobacterium tumefaciens नामक बैक्टीरिया का उपयोग किया। यह बैक्टीरिया एक प्राकृतिक आनुवंशिक इंजीनियर है; प्रकृति में, यह पौधों को संक्रमित करता है और अपना डीएनए उनमें स्थानांतरित करता है। वैज्ञानिकों ने इस क्षमता का लाभ उठाया है, जिसमें बैक्टीरिया के हानिकारक डीएनए को उस लाभकारी जीन से बदल दिया गया है जिसका वे अध्ययन करना चाहते हैं। शोधकर्ताओं ने बैक्टीरिया को एक तरल कल्चर में तब तक उगाया जब तक कि वह एक विशिष्ट घनत्व तक नहीं पहुँच गया, फिर उन्होंने बैक्टीरिया को ब्लूबेरी कैलस के साथ मिला दिया।

इस संक्रमण की सफलता काफी हद तक समय पर निर्भर थी। टीम ने विभिन्न स्थितियों का परीक्षण किया ताकि वह सही समय (sweet spot) मिल सके जहाँ बैक्टीरिया नाजुक पादप कोशिकाओं को मारे बिना जीन स्थानांतरित कर सके। उन्होंने पाया कि कैलस को दस मिनट के लिए बैक्टीरिया के घोल में डुबोना इष्टतम अवधि थी। यदि एक्सपोजर बहुत कम होता, तो बैक्टीरिया जीन देने में विफल रहता। यदि यह बहुत लंबा होता, तो पौधे की कोशिकाएं क्षतिग्रस्त हो जातीं और मर जातीं। इस संक्षिप्त संक्रमण के बाद, जीन स्थानांतरण को प्रभावी होने देने के लिए कैलस को तीन दिनों के लिए एक अंधेरे वातावरण में रखा गया। इसके बाद, कोशिकाओं को एंटीबायोटिक्स युक्त एक विशेष विकास माध्यम में स्थानांतरित किया गया। इन एंटीबायोटिक्स ने दोहरा उद्देश्य पूरा किया: उन्होंने शेष बैक्टीरिया को मार दिया और अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि उन्होंने उन ब्लूबेरी कोशिकाओं को भी मार दिया जिन्होंने नए जीन को स्वीकार करने में विफलता दिखाई थी। केवल वे कोशिकाएं जिन्होंने VdMYB56 जीन को सफलतापूर्वक एकीकृत किया था, उनमें एक प्रतिरोध मार्कर (resistance marker) था जिसने उन्हें एंटीबायोटिक उपचार में जीवित रहने की अनुमति दी।

इस स्क्रीनिंग प्रक्रिया के परिणाम चौंकाने वाले थे। शोधकर्ता लगभग ग्यारह प्रतिशत की रूपांतरण दक्षता प्राप्त करने में सफल रहे, जिसका अर्थ है कि प्रत्येक सौ उपचारित कोशिकाओं में से, लगभग ग्यारह ने नए जीन को सफलतापूर्वक शामिल किया और चयन प्रक्रिया में जीवित रहे। जैसे-जैसे जीवित कोशिकाएं बढ़ीं, एक दृश्य परिवर्तन हुआ। जबकि अनुपचारित, जंगली प्रकार (wild-type) की ब्लूबेरी कोशिकाएं हल्के पीले रंग की बनी रहीं, संशोधित कोशिकाएं गहरे, जीवंत लाल रंग में बदलने लगीं। यह रंग परिवर्तन पहला भौतिक संकेत था कि VdMYB56 जीन अपने इच्छित कार्य के रूप में काम कर रहा था, जो एंथोसायनिन के उत्पादन को सक्रिय कर रहा था।

यह पुष्टि करने के लिए कि इन लाल कोशिकाओं के भीतर क्या हो रहा है, शोधकर्ताओं ने नए जीन और इसके द्वारा नियंत्रित एंजाइमों के स्तर को मापा। उन्होंने पाया कि संशोधित कोशिकाओं में VdMYB56 जीन का स्तर जंगली प्रकार की तुलना में बहुत अधिक था। अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि इस मास्टर जीन की वृद्धि ने एक कैस्केड प्रभाव (cascade effect) पैदा किया, जिससे Vd3GT नामक एक डाउनस्ट्रीम एंजाइम की गतिविधि बढ़ गई, जो सीधे तौर पर एंथोसायनिन पिगमेंट को स्थिर करने के लिए जिम्मेदार है। संशोधित कैलस में एंथोसायनिन की कुल मात्रा बिना संशोधित पौधों की तुलना में 3.56 गुना तक अधिक थी। पिगमेंट में चीनी के अणुओं को जोड़ने के लिए जिम्मेदार एंजाइम की गतिविधि, जो रंग को स्थिर रखने में मदद करती है, संशोधित लाइनों में चार गुना से अधिक थी।

अंतिम चरण इन लाल, आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिका द्रव्यमान को नए पौधे की संरचनाओं में बदलना था। शोधकर्ताओं ने लाल कैलस को एक नए विकास माध्यम पर रखा जो छोटे अंकुरों, जिन्हें एडवेंटिशियस बड्स (adventitious buds) कहा जाता है, के निर्माण को प्रोत्साहित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। उन्होंने इस विकास को निर्देशित करने के लिए थिडियाज़ुरोन और नेफ्थलीनएसिटिक एसिड सहित हार्मोन के एक विशिष्ट संयोजन का उपयोग किया। परिणाम ब्लूबेरी एडवेंटिशियस बड लाइनों का एक सेट था जो संशोधित कोशिकाओं से विकसित हुए। इन नई लाइनों को, जिन्हें शोधकर्ताओं ने VdMYB56-ओवरएक्सप्रेसिंग लाइन्स नाम दिया, कैलस चरण में देखे गए लाल रंग को बनाए रखा। जब उन्होंने इन नई लाइनों का विश्लेषण किया, तो डेटा ने पिछले निष्कर्षों की पुष्टि की। सामान्य ब्लूबेरी पौधों की तुलना में इन नए अंकुरों में VdMYB56 जीन की अभिव्यक्ति दो से चौबीस गुना तक अधिक थी। फलस्वरूप, Vd3GT एंजाइम का स्तर भी काफी बढ़ गया, जो जंगली प्रकार की तुलना में दस से बीस गुना अधिक था।

भौतिक साक्ष्य निर्विवाद थे। नई ब्लूबेरी लाइनों ने स्पष्ट रूप से लाल एडवेंटिशियस बड्स का उत्पादन किया, जो समान परिस्थितियों में उगाए गए जंगली प्रकार के पौधों के हरे अंकुरों के बिल्कुल विपरीत थे। इन लाल लाइनों में एंथोसायनिन की कुल मात्रा नियंत्रण पौधों की तुलना में 4.52 गुना तक अधिक थी। इसके अलावा, इन पिगमेंट को उत्पन्न करने के लिए जिम्मेदार एंजाइमी गतिविधि सभी सफल लाइनों में लगातार उच्च थी। शोधकर्ताओं ने पांच अलग-अलग लाइनों की पहचान की जिन्होंने लगातार इन उन्नत लक्षणों को प्रदर्शित किया, जिससे पुष्टि हुई कि आनुवंशिक संशोधन नए ऊतकों में स्थिर और वंशानुगत (heritable) था।

यह कार्य यह प्रदर्शित करता है कि आनुवंशिक इंजीनियरिंग के माध्यम से ब्लूबेरी में सुधार करने की बाधा अपरिहार्य नहीं है। कोशिका विकास, बैक्टीरिया संक्रमण और एंटीबायोटिक चयन की स्थितियों को सावधानीपूर्वक अनुकूलित करके, टीम ने रैबिटआई ब्लूबेरी में नए गुणों को पेश करने के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली बनाई। एंथोसायनिन के स्तर को बढ़ाने में VdMYB56 जीन की सफलता यह सुझाव देती है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग ऐसी नई ब्लूबेरी किस्में बनाने के लिए किया जा सकता है जो न केवल अधिक रंगीन हैं बल्कि उन स्वास्थ्य-वर्धक यौगिकों से भी समृद्ध हैं जो इस फल को इतना मूल्यवान बनाते हैं। यह अध्ययन पादप प्रजनकों के लिए नया जर्मप्लाज्म (germplasm) बनाने के लिए एक ठोस विधि प्रदान करता है, जो पारंपरिक, समय लेने वाले क्रॉस-ब्रीडिंग तरीकों पर निर्भर किए बिना उन्नत पोषण प्रोफाइल वाली ब्लूबेरी विकसित करने का मार्ग प्रशस्त करता है। प्रयोगशाला में खड़े लाल अंकुर केवल एक दृश्य जिज्ञासा नहीं हैं; वे इस ठोस प्रमाण हैं कि इस फल की आनुवंशिक क्षमता को अनलॉक किया जा सकता है और इसे विशिष्ट, लाभकारी परिणामों की ओर निर्देशित किया जा सकता है।