An Instrument for Physical Vapor Deposition onto Cryo-EM Samples for Microsecond Time-Resolved Cryo-EM

Dieser Artikel stellt den Entwurf und Betrieb einer Apparatur zur physikalischen Gasphasenabscheidung für Kryo-EM-Proben vor, die zeitaufgelöste Experimente im Mikrosekundenbereich ermöglicht, indem Verbindungen auf gefrorene Gitter aufgebracht werden, um ein nachfolgendes Laser-Blitzschmelzen zu erlauben, und demonstriert ihre Nützlichkeit bei der Optimierung von Versiegelungsmembranen und der Initiierung von Proteindynamik.

Das Wesentliche

Stellen Sie sich vor, Sie versuchen, ein Hochgeschwindigkeitsfoto eines Proteins zu machen, der winzigen Maschine in unseren Zellen, die die ganze Arbeit verrichtet. Normalerweise müssen Wissenschaftler, um diese Bilder mit einem Elektronenmikroskop aufzunehmen, das Protein sofort einfrieren, ähnlich wie eine Fliege im Flug schockgefrostet wird. Dies nennt man Kryo-EM.

Doch es gibt ein Problem: Sobald es gefroren ist, ist das Protein festgefroren. Es kann sich nicht bewegen, sodass Sie nicht sehen können, wie es funktioniert. Kürzlich haben Wissenschaftler herausgefunden, wie man diese gefrorenen Proben für nur einen winzigen Bruchteil einer Sekunde (Mikrosekunden) „schnell auftaut" und sie dann sofort wieder einfriert. Dies ermöglicht es ihnen, das Protein mitten in einer Bewegung zu erfassen, wie bei einem Foto eines Tänzers in der Luft.

Doch es gab einen Haken. Wenn man das Eis schmelzen lässt, schwebt das Protein in einem winzigen Wassertropfen. Wenn dieser Tropfen die Luft berührt, bleibt das Protein an der Oberfläche haften und kann sich nicht frei drehen, was es schwierig macht, es aus allen Winkeln zu sehen. Außerdem kann man, wenn man untersuchen möchte, wie ein Protein auf eine neue Chemikalie (wie ein Medikament) reagiert, die Chemikalie nicht einfach auf eine gefrorene Probe gießen; sie würde sich nicht vermischen.

Die Lösung: Ein „Vakuum-Farbsprüher" für gefrorene Proben

Diese Arbeit beschreibt eine neue Maschine, die entwickelt wurde, um diese Probleme zu lösen. Stellen Sie sich eine hochtechnologische, vakuumversiegelte Spritzkabine vor, die speziell für gefrorene Mikroskopobjektträger konzipiert ist.

So funktioniert es, unter Verwendung einfacher Analogien:

1. Die „Sandwich"-Technik (Versiegeln der Probe)
Stellen Sie sich Ihr gefrorenes Protein als ein zartes Sandwich vor. Normalerweise sind die Ober- und Unterseite der Luft ausgesetzt. Die neue Maschine kann eine unglaublich dünne Schicht „Glas" (Siliziumdioxid) auf die Ober- und Unterseite des Sandwichs sprühen, während es noch gefroren ist.

• Warum dies tun? Es versiegelt das Wasser im Inneren, damit es beim Schmelzen nicht verdampft. Es drückt das Protein auch von der Luft weg, sodass es sich frei drehen kann, wenn der Laser das Eis schmelzen lässt.
• Die Entdeckung: Die Wissenschaftler testeten, wie dünn dieses „Glas" sein konnte. Sie stellten fest, dass das Glas, wenn es zu dünn ist (weniger als zwei Atomlagen), winzige Löcher hat und das Wasser austritt. Wenn es jedoch etwas mehr als zwei Lagen dick ist, hält es perfekt. Dies ist der dünnstmögliche „Verschluss", den sie verwenden können.

2. Die „Magischer Staub"-Technik (Mischen von Chemikalien)
Stellen Sie sich einen gefrorenen Kuchen vor, und Sie möchten sehen, was passiert, wenn Sie Schokoladenstückchen hinzufügen, aber den Kuchen nicht zuerst auftauen können.

• Der alte Weg: Das konnte man mit gefrorenen Proben eigentlich nicht machen.
• Der neue Weg: Diese Maschine kann einen feinen Staub aus Chemikalien (wie Calciumsalzen) auf die gefrorene Probe sprühen. Der Staub sitzt oben und wartet.
• Der Auslöser: Wenn die Wissenschaftler die Probe mit einem Laserpuls treffen, um sie für einen splitternden Moment zu schmelzen, verwandelt sich das Eis in Wasser, und der „Staub" löst sich sofort auf und vermischt sich mit dem Protein.
• Der Beweis: Die Wissenschaftler testeten dies, indem sie Calciumstaub auf eine Probe sprühten, die einen speziellen Farbstoff enthielt, der rot leuchtet. Als der Laser das Eis schmolz, mischte sich das Calcium mit dem Farbstoff, und das Leuchten wurde schwächer. Dies bewies, dass sich die Chemikalien im Handumdrehen perfekt vermischten.

Warum dies wichtig ist
Diese Maschine ist wie eine Universalfernbedienung für gefrorene Biologie. Sie ermöglicht Wissenschaftlern:

1. Die Probe zu schützen, damit sie nicht verdampft oder feststeckt.
2. Zutaten (wie Medikamente oder Chemikalien) zur Probe hinzuzufügen, nachdem sie gefroren ist, aber bevor das Experiment beginnt.
3. Alles sofort zu mischen, indem ein Laser verwendet wird, um das Eis zu schmelzen und die Reaktion genau dann auszulösen, wenn sie beobachten möchten.

Die Autoren schlagen vor, dass diese Maschine zur Standard„Küche" für zukünftige Experimente werden könnte, in der Wissenschaftler komplexe, mehrstufige Experimente durchführen können, indem sie abwechselnd Zutaten hinzufügen und die Probe schnell auftauen, alles, ohne die Probe jemals aus der Maschine zu nehmen.

Zusammenfassung
Die Arbeit stellt ein Werkzeug vor, das Wissenschaftlern ermöglicht, gefrorene Proben mit schützendem Glas oder chemischem Staub zu „bemalen". Wenn sie die Probe mit einem Laser zünden, schmilzt das Eis, die Farbe verwandelt sich in eine Flüssigkeit, und die Chemikalien vermischen sich sofort. Dies ermöglicht es ihnen, Proteine in Echtzeit bewegen und reagieren zu sehen und das Problem zu lösen, wie man Zutaten in einem splitternden Moment mit einer gefrorenen Probe mischt.

Technische Zusammenfassung

Technische Zusammenfassung: Ein Instrument für die physikalische Gasphasenabscheidung auf Kryo-EM-Proben für die Mikrosekunden-Zeitauflösungs-Kryo-EM

Problem und Kontext
Die auf Laser-Flash-Schmelzen basierende Mikrosekunden-Zeitauflösungs-Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat kürzlich die Beobachtung von Proteindynamiken im Mikrosekundenbereich ermöglicht. Diese Technik umfasst das kurze Aufschmelzen einer gefrorenen Probe mit einem Laserpuls zur Initiierung von Dynamiken, gefolgt von einer schnellen Revitrifizierung, um transienten Konfigurationen einzufrieren. Obwohl dieser Ansatz die zeitliche Auflösung der Kryo-EM erweitert hat, hat er auch neue Möglichkeiten für die Probenvorbereitung aufgezeigt. Insbesondere bietet die Fähigkeit, Verbindungen vor dem Flash-Schmelzen auf gefrorene Proben aufzubringen, eine Methode, um die Probenumgebung dynamisch zu verändern. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Abscheidung von amorphem Eis oder Siliziumdioxid-Membranen eine bevorzugte Partikelausrichtung mindern kann, indem Partikel von der Luft-Wasser-Grenzfläche getrennt werden. Jedoch fehlte ein dediziertes Instrument, um die physikalische Gasphasenabscheidung (PVD) nichtflüchtiger Verbindungen direkt auf Kryo-EM-Proben innerhalb eines Vakuumumfelds durchzuführen, was die Möglichkeit einschränkte, Reagenzien einzuführen oder ultradünne Flüssigzellen-Geometrien für diese Experimente zu schaffen.

Methodik
Die Autoren beschreiben den Entwurf und den Betrieb einer maßgeschneiderten Vakuumapparatur, die für die physikalische Gasphasenabscheidung auf Kryo-EM-Proben entwickelt wurde. Das Instrument verfügt über eine sechswegige Vakuumkammer aus Edelstahl, die auf $3 \times 10^{-8}$ mbar evakuiert wird. Kryo-EM-Proben werden über einen umfunktionierten Einlass einer JEOL 2010 Transmissionselektronenmikroskop geladen, der in eine motorisierte Dreheinheit integriert ist. Dieses Setup ermöglicht das Drehen des Probenhalters, wodurch eine Abscheidung auf einer oder beiden Seiten der Probe möglich ist.

Das System unterstützt zwei Abscheidungsmodi:

1. Gasdosierung: Flüchtige Verbindungen werden über ein Gasdosierventil eingeführt, was eine gleichzeitige Abscheidung auf beiden Seiten der Probe ermöglicht.
2. Elektronenstrahlverdampfung: Verbindungen mit niedrigem Dampfdruck werden mittels eines Elektronenstrahlverdampfers abgeschieden. Das System verwendet einen Tantal-Tiegel mit einer Graphitauskleidung, der durch einen Elektronenstrahl erhitzt wird, der von einer widerstandsheizenden Wolframspule erzeugt wird. Ein effusiver Strahl wird durch eine 1-mm-Öffnung gebildet.

Um eine präzise Kontrolle sicherzustellen, wird die Abscheidungsrate aktiv über einen Regelkreis stabilisiert, der auf einem Ionenstrom basiert, der durch Ionisierung eines Teils des effusiven Strahls erzeugt wird. Dieses Signal wird gegen einen Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) kalibriert. Die Autoren stellen fest, dass die QCM-Anzeige aufgrund der Strahlungserwärmung zwar etwa 40 % höher als die tatsächliche Rate liegt, die lineare Beziehung zwischen Ionenstrom und Abscheidungsrate jedoch ein schnelles Einstellen gewünschter Raten ermöglicht. Die Probe wird während des gesamten Prozesses auf kryogenen Temperaturen (~100 K) gehalten, um eine Devitrifizierung zu verhindern.

Hauptbeiträge und Ergebnisse
Der Artikel liefert eine detaillierte Charakterisierung des Instruments durch zwei primäre Demonstrationen:

1. Bestimmung der minimalen Membrandicke: Die Autoren nutzten das Instrument, um Siliziumdioxid ($SiO_2$)-Membranen auf Kryo-EM-Proben aufzubringen, um ultradünne Flüssigzellen zu erzeugen. Sie untersuchten die minimale Dicke, die diese Membranen benötigen, um dem Flash-Schmelz- und Revitrifizierungsprozess standzuhalten, ohne zu versagen.

   • Membranen von ungefähr 0,75 nm (etwa 2 Monolagen) verschlossen die Probe erfolgreich, verhinderten die Verdampfung und erhielten nach einem 30-µs-Laserpuls einen gleichmäßigen dünnen Flüssigfilm.
   • Membranen, die auf ~0,5 nm (weniger als 2 Monolagen) reduziert wurden, versagten und zeigten Kontrastvariationen, die auf eine Verdampfung der Probe durch Poren hindeuteten.
   • Dies etabliert, dass die minimale funktionelle Dicke für abdichtende Membranen in dieser Geometrie knapp über zwei Monolagen liegt.

2. Mikrosekunden-Mischexperimente: Die Autoren demonstrierten die Machbarkeit, Proteindynamiken durch das Aufbringen von Reagenzien auf die Probe zu initiieren.

   • Eine Kryo-EM-Probe, die den Calcium-Sensitiv-Farbstoff Fura Red enthielt, wurde vorbereitet.
   • Eine 0,5 nm dicke Schicht wasserfreies Calciumchlorid ($CaCl_2$) wurde auf eine Seite der Probe aufgedampft.
   • Beim Flash-Schmelzen mit einem 50-µs-Laserpuls mischten sich die Calciumionen mit der Probe.
   • Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte, dass die Fluoreszenzintensität von Fura Red im revitrifizierten Bereich abnahm, was auf die Bindung von Calciumionen an den Farbstoff hindeutet. Kontrollexperimente ohne aufgedampftes $CaCl_2$ zeigten keine solche Kontraständerung.

Bedeutung und Behauptungen
Die Autoren behaupten, dass dieses Instrument die Grundlage für eine integrierte Plattform für die Mikrosekunden-Zeitauflösungs-Kryo-EM bildet. Durch die Ermöglichung der physikalischen Gasphasenabscheidung von Verbindungen auf gefrorene Proben erlaubt das System:

• Die Erzeugung ultradünner Flüssigzellen, die dünne Filme stabilisieren und das Beobachtungsfenster von zehn auf hundert Mikrosekunden erweitern.
• Eine neue Strategie zur Initiierung von Proteindynamiken, bei der Reagenzien (wie kleine Moleküle oder Liganden) aufgebracht und beim Flash-Schmelzen schnell mit der Probe gemischt werden, wodurch die Notwendigkeit von photokäfigten Verbindungen umgangen wird.
• Das Potenzial für eine zukünftige Integration mit Soft-Landing-Massenspektrometrie-Ansätzen, um größere, nichtflüchtige Biomoleküle wie Peptide oder Proteine abzuscheiden.

Der Artikel kommt zu dem Schluss, dass dieser integrierte Ansatz die Probenkontamination durch Minimierung von Transferprozessen reduziert und komplexe experimentelle Sequenzen ermöglicht, die Abscheidung und Laser-Revitrifizierung abwechseln, wodurch das Spektrum zugänglicher Proteindynamiken erweitert wird.