Two-photon characterisation of long-Stokes-shift dye ATTO 490LS for single-laser multicolour imaging

Die Studie charakterisiert die Zwei-Photonen-Eigenschaften des Fluorophors ATTO 490LS und demonstriert dessen erfolgreiche Anwendung für die Mehrfarben-Bildgebung in Drosophila-Gehirnen mittels eines einzigen 920-nm-Lasers.

Das Wesentliche

Ein neuer Trick für das Mikroskop: Wie man mit nur einem Laser zwei Farben gleichzeitig sieht

Stellen Sie sich vor, Sie sind ein Detektiv, der in einem riesigen, dunklen Wald (dem Gehirn einer Fruchtfliege) nach Spuren sucht. Normalerweise braucht man für jede Spur eine andere Taschenlampe: Eine rote Lampe für rote Spuren, eine blaue für blaue. Aber was, wenn Sie nur eine einzige Taschenlampe haben? Das ist das Problem, mit dem viele Wissenschaftler in der Mikroskopie kämpfen.

Diese neue Studie ist wie die Erfindung eines magischen Farbstoffs, der es erlaubt, mit nur einer einzigen Taschenlampe zwei völlig verschiedene Dinge gleichzeitig zu beleuchten und zu unterscheiden.

Hier ist die Geschichte, einfach erklärt:

1. Das Problem: Der "Licht-Überlapp"

In der Welt der Mikroskopie gibt es einen lästigen Trick der Natur: Wenn man etwas mit Licht anstrahlt, leuchtet es oft in einer Farbe, die der des Lichts sehr ähnlich ist. Das ist wie wenn Sie versuchen, eine rote Kerze in einem Raum mit rotem Licht zu sehen – man kann sie kaum unterscheiden.

Um zwei Dinge gleichzeitig zu sehen (z. B. grüne und rote Strukturen im Gehirn), braucht man normalerweise zwei verschiedene Laser. Das ist teuer und kompliziert, wie ein Auto mit zwei Motoren, die man separat starten muss. Viele Labore haben aber nur "einzelne" Laser, die auf eine feste Farbe eingestellt sind (in diesem Fall ein Laser, der wie ein rotes Licht aussieht, aber unsichtbar ist: 920 Nanometer).

2. Der Held: Der "ATTO 490LS"-Farbstoff

Die Forscher haben einen speziellen Farbstoff namens ATTO 490LS getestet. Dieser Stoff hat eine besondere Superkraft: Er hat einen langen "Stokes-Shift".

• Die Analogie: Stellen Sie sich vor, Sie werfen einen Ball (das Licht) gegen eine Wand. Ein normaler Ball springt fast genau in die Richtung zurück, aus der er kam (kurzer Abstand). Dieser spezielle Farbstoff ist wie ein Ball, der die Wand trifft, eine riesige Achterbahnfahrt macht und dann in einer völlig anderen Richtung und mit einer völlig anderen Energie zurückkommt (langer Abstand).
• In der Praxis: Der Farbstoff kann von demselben unsichtbaren Laser angeregt werden, der auch grüne Proteine (wie GCaMP, die Nervenaktivität anzeigen) zum Leuchten bringen. Aber während die grünen Proteine grün leuchten, leuchtet dieser neue Stoff tiefrot.

3. Der Experiment: Ein Tanz im Dunkeln

Die Wissenschaftler haben Fruchtfliegen-Gehirne präpariert. Sie haben zwei Dinge markiert:

1. Grün: Ein Protein, das die Struktur der Nervenzellen zeigt (wie ein grüner Sicherheitsstreifen).
2. Rot: Den neuen ATTO 490LS-Farbstoff, der an bestimmte Proteine gebunden wurde.

Dann haben sie den einzigen Laser (bei 920 nm) eingeschaltet.

• Das Ergebnis: Der Laser hat beide Farben gleichzeitig angeregt!
• Der Clou: Da der rote Farbstoff so einen "langen Sprung" macht, leuchtet er in einem Bereich (um 640 nm), der weit genug vom grünen Licht entfernt ist. Die Wissenschaftler konnten mit zwei verschiedenen "Augen" (Detektoren) schauen:
  • Das eine Auge sah nur das Grün.
  • Das andere Auge sah nur das Rot.

Es war, als ob sie mit einer einzigen Taschenlampe in einen Raum geschaut hätten und plötzlich zwei verschiedene Farben von Objekten klar voneinander getrennt sehen konnten, ohne dass sich die Farben vermischten.

4. Warum ist das so wichtig?

Stellen Sie sich vor, Sie wollen ein Auto reparieren. Früher mussten Sie zwei verschiedene Werkzeuge kaufen, um zwei Schrauben zu lösen. Jetzt haben Sie ein Werkzeug, das beides kann.

• Für Labore: Viele Labore haben teure, alte Mikroskope mit nur einem Laser. Früher konnten sie damit nicht zwei Farben gleichzeitig gut untersuchen. Mit diesem neuen Trick können sie jetzt "Duplex-Imaging" (Zwei-Farben-Bilder) machen, ohne neue, teure Geräte kaufen zu müssen.
• Für die Wissenschaft: Man kann jetzt die Struktur eines Neurons (rot) und gleichzeitig dessen Aktivität (grün, z. B. wenn ein Signal durch das Gehirn fließt) live beobachten. Das ist wie ein Film, der zeigt, nicht nur wie ein Haus aussieht, sondern auch, wann die Lichter in den einzelnen Zimmern angehen.

Zusammenfassung

Die Forscher haben bewiesen, dass der Farbstoff ATTO 490LS wie ein genialer Übersetzer funktioniert. Er nimmt das Licht eines einzigen Lasers, der eigentlich für grüne Dinge gedacht ist, und wandelt es in ein klares rotes Signal um. So können Wissenschaftler mit einem einzigen Gerät zwei verschiedene Welten im Gehirn gleichzeitig sehen – ein großer Schritt für die Erforschung des Gehirns, der auch mit älterer Ausrüstung möglich ist.

Technische Zusammenfassung

Technische Zusammenfassung: Charakterisierung des LSS-Farbstoffs ATTO 490LS für die Einzel-Laser-Zwei-Photonen-Mikroskopie

1. Problemstellung

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie (2P) ist ein Standardverfahren für die hochauflösende Bildgebung in biologischen Geweben, insbesondere im lebenden Gehirn von Drosophila melanogaster. Ein häufiges technisches Limit besteht darin, dass viele Mikroskope nur über einen einzigen fest eingestellten Laser (typischerweise bei 920 nm zur Anregung von grün fluoreszierenden Proteinen wie GCaMP) verfügen.

• Herausforderung: Für die gleichzeitige Mehrfarben-Bildgebung (Duplexing) mit einem einzigen Laser sind herkömmliche Fluorophore oft ungeeignet, da ihre Anregungsspektren zu stark überlappen oder ihre Emissionsspektren nicht ausreichend vom Anregungslaser getrennt sind (kurze Stokes-Verschiebung).
• Spezifisches Ziel: Es fehlte an einer Charakterisierung von ATTO 490LS, einem Farbstoff mit einer langen Stokes-Verschiebung (Long-Stokes-Shift, LSS), für die Zwei-Photonen-Anregung. Unter Ein-Photonen-Bedingungen zeigt ATTO 490LS eine Stokes-Verschiebung von 165 nm (Anregung bei ~496 nm, Emission bei ~661 nm), aber seine Eignung für 2P-Mikroskopie war unbekannt.

2. Methodik

Die Autoren führten eine umfassende spektrale und bildgebende Charakterisierung durch:

• Probenpräparation:
  • Verwendung von Drosophila-Gehirnen (Genotyp: elav-Gal4 > UAS-TID-Dlg1).
  • BioID-Proximity-Labeling: Expression von TurboID-Dlg1 in Neuronen, gefolgt von der Zugabe von Biotin zur Biotinylierung proximaler Proteine.
  • Färbung: Bindung von streptavidin-konjugiertem ATTO 490LS an die biotinylierten Proteine.
  • Dual-Labeling: Gleichzeitige Färbung mit einem Anti-c-Myc-Antikörper und einem Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper (zur Markierung von Dlg1).
• Spektrale Analysen (Ex vivo):
  • Anregungs-Scan (Excitation Scan): Messung der Emissionsintensität bei variierenden Anregungswellenlängen (680–1200 nm) unter Verwendung eines abstimmbaren Femtosekunden-Lasers (Leica TCS SP8 DIVE).
  • Emissions-Scan (Emission Scan): Messung des Emissionsspektrums bei fixierten Anregungswellenlängen (780 nm, 920 nm, 940 nm, 1040 nm).
• Zwei-Photonen-Bildgebung:
  • Durchführung auf Thorlabs-Mikroskopen (A-SCOPE und B-SCOPE) mit einem festen 920-nm-Faserlaser.
  • Detektion mittels zweier Photomultiplier-Röhren (PMTs):
    • Grün-Filter (500–550 nm) für Alexa Fluor 488.
    • Rot-Filter (570–640 nm bzw. 605/70 nm) für ATTO 490LS.
  • Vergleich der Signale bei unterschiedlichen Laserleistungen und Verstärkungen.

3. Wichtige Beiträge und Ergebnisse

• Charakterisierung der optischen Eigenschaften:

  • Anregungsoptimum: Der Anregungs-Scan identifizierte drei lokale Maxima bei 780 nm, 940 nm und 1040 nm. Obwohl 780 nm die höchste Intensität lieferte, wurde 940 nm als vielversprechendste Wellenlänge für die Kompatibilität mit Standard-920-nm-Lasern identifiziert.
  • Emissionsspektrum: Bei allen getesteten Anregungswellenlängen (inklusive 920 nm) zeigte ATTO 490LS ein Emissionsmaximum bei 640 nm. Dies bestätigt die lange Stokes-Verschiebung auch unter Zwei-Photonen-Bedingungen.
  • Signal-zu-Rausch-Verhältnis: Die Anregung bei 920 nm erzeugte deutlich weniger Autofluoreszenz im Vergleich zu kürzeren Wellenlängen (z. B. 780 nm), was die Detektionssensitivität verbessert.

• Erfolgreiche Duplex-Bildgebung:

  • Die Studie demonstrierte erstmals die gleichzeitige Bildgebung von ATTO 490LS (rot) und Alexa Fluor 488 (grün) unter einzelner 920-nm-Anregung.
  • Spezifische Strukturen: Es konnten klar unterscheidbare Signale in verschiedenen Hirnregionen nachgewiesen werden:
    • Ellipsoidkörper: Nur durch ATTO 490LS markiert.
    • γ-Lappen des Pilzkörpers: Nur durch Alexa Fluor 488 markiert.
    • α- und β-Lappen des Pilzkörpers: Doppelmarkierung durch beide Farbstoffe.
  • Die spektrale Trennung war so effektiv, dass keine signifikante Kreuzanregung oder Überlappung der Emissionssignale die Unterscheidung der Kanäle beeinträchtigte.

4. Bedeutung und Ausblick

• Technische Barriere-Senkung: Die Arbeit etabliert ATTO 490LS als robustes Werkzeug für die Mehrfarben-Zwei-Photonen-Mikroskopie auf Systemen mit nur einem festen 920-nm-Laser. Dies macht die Technik für Labore mit älterer oder kostengünstigerer Hardware ("Legacy Equipment") zugänglich, die keine abstimmbaren Laser besitzen.
• Erweiterung des Werkzeugkastens: Die Ergebnisse legen den Grundstein für die Entwicklung von ATTO 490LS-konjugierten Liganden für genetische Tags (HaloTag, SNAP-tag).
• Zukünftige Anwendungen: Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung von funktionellen Daten (z. B. Calcium-Transiente via GCaMP, grün) und strukturellen Markern oder Sensoren (rot) in lebenden, verhaltensfähigen Tieren. Dies ist ein entscheidender Schritt für die Integration von Funktions-, Genetik- und Verhaltensanalysen in der Neurobiologie.

Fazit: Das Papier liefert den experimentellen Beweis, dass ATTO 490LS ein hochwirksamer, lang-stokes-verschobener Farbstoff für die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist, der die gleichzeitige Multicolor-Bildgebung mit einem einzigen 920-nm-Laser ermöglicht und damit neue Möglichkeiten für die neuronale Netzwerkanalyse eröffnet.