Two-photon characterisation of long-Stokes-shift dye ATTO 490LS for single-laser multicolour imaging

Este estudio caracteriza las propiedades de excitación de dos fotones del fluoróforo ATTO 490LS y demuestra su utilidad para la imagen multicolor en microscopía de dos fotones utilizando un solo láser.

Lo esencial

¡Claro que sí! Imagina que este artículo es como una receta de cocina para una nueva herramienta que permite a los científicos "ver" el cerebro de las moscas de una manera mucho más brillante y eficiente. Aquí tienes la explicación, traducida al español y con algunas analogías divertidas:

🧠 El Problema: Ver el cerebro con una sola linterna

Imagina que quieres tomar una foto de un cerebro de mosca para ver cómo funcionan sus neuronas. Para ver cosas tan pequeñas, los científicos usan un microscopio especial que funciona con un láser (una luz muy potente y precisa).

El problema es que muchos de estos microscopios solo tienen una sola linterna (un solo láser de un color específico, en este caso, verde-azulado).

• Si quieres ver dos cosas diferentes al mismo tiempo (por ejemplo, las neuronas que se activan y las estructuras que las sostienen), normalmente necesitarías dos linternas de colores distintos para que no se mezclen.
• Pero si solo tienes una linterna, todo lo que ilumines se verá del mismo color y será imposible distinguir una cosa de la otra. Es como intentar ver un letrero rojo y uno verde en la oscuridad usando solo una linterna blanca: todo se verá blanco y no sabrás qué es qué.

💡 La Solución: El "Camaleón" Mágico (ATTO 490LS)

Aquí es donde entra el héroe de esta historia: un tinte llamado ATTO 490LS.

Piensa en este tinte como un camaleón mágico o un transformista:

1. La entrada: Cuando le das luz (lo excitas) con el láser verde-azulado de tu única linterna, este tinte absorbe la energía.
2. El truco: Aquí viene la magia. En lugar de devolver la luz del mismo color (verde), este tinte tiene un "cambio de longitud de onda" muy grande (lo llaman Long-Stokes Shift). Es como si el tinte tomara la luz verde, la pasara por un filtro de energía, y la devolviera como una luz roja brillante.
3. El resultado: ¡De repente, tienes dos colores distintos saliendo de la misma linterna!
   • Unas cosas brillan en verde (como el tinte Alexa 488 o las proteínas naturales).
   • Otras cosas brillan en rojo (gracias al tinte ATTO 490LS).

🔬 ¿Qué hicieron los científicos?

Los investigadores tomaron cerebros de moscas y les pusieron dos tipos de "pintura":

1. Una pintura verde (Alexa 488) para marcar ciertas partes del cerebro.
2. La pintura "camaleón" roja (ATTO 490LS) para marcar otras partes.

Luego, usaron su microscopio con solo un láser (una linterna de 920 nanómetros, que es un tipo de luz infrarroja especial para ver dentro de los tejidos).

El milagro:
Al encender esa única linterna:

• La pintura verde se iluminó en verde.
• La pintura roja se iluminó en rojo.
• Y lo mejor: ¡No se mezclaron! Los científicos pudieron ver claramente qué partes eran verdes y cuáles eran rojas, todo al mismo tiempo.

🚀 ¿Por qué es importante esto?

Imagina que eres un mecánico de coches. Antes, para ver el motor y el sistema eléctrico al mismo tiempo, necesitabas dos herramientas diferentes y dos luces. Ahora, con esta nueva "linterna mágica", puedes ver todo con una sola herramienta.

• Ahorro de dinero: Muchos laboratorios tienen microscopios viejos que solo tienen un láser. Con este descubrimiento, no necesitan comprar un microscopio nuevo y carísimo; pueden usar el que ya tienen y hacer mucho más.
• Mejor visión: Pueden ver la estructura del cerebro (rojo) y la actividad de las neuronas (verde) simultáneamente sin que una interfiera con la otra. Es como ver un mapa de carreteras (estructura) y el tráfico en tiempo real (actividad) en la misma pantalla.

En resumen

Este artículo nos dice que han probado un nuevo tinte (ATTO 490LS) que actúa como un traductor de colores. Convierte la luz de un láser único en un color rojo brillante, permitiendo a los científicos ver dos cosas diferentes en el cerebro de una mosca al mismo tiempo, sin necesidad de equipos costosos y nuevos. ¡Es una forma inteligente y económica de ver el mundo microscópico con más claridad!

Resumen técnico

Resumen Técnico: Caracterización de la tinción ATTO 490LS para imagen multiphotónica de un solo láser

1. Problema y Contexto

La microscopía de dos fotones (2P) es una herramienta fundamental para la imagenología profunda en tejidos biológicos, como el cerebro de Drosophila. Sin embargo, muchos sistemas de microscopía de laboratorio, especialmente modelos más antiguos o de menor costo, están equipados únicamente con un láser de fibra de longitud de onda fija (generalmente 920 nm). Esto limita severamente la capacidad de realizar imágenes multicolores (dúplex o multiplexadas), ya que la mayoría de los fluoróforos verdes (como GCaMP o Alexa 488) y rojos requieren longitudes de onda de excitación diferentes para ser distinguidos sin solapamiento espectral.

Los fluoróforos con desplazamiento de Stokes largo (LSS, por sus siglas en inglés) ofrecen una solución teórica: son excitados por una longitud de onda corta pero emiten en una longitud de onda mucho más larga, reduciendo el solapamiento entre excitación y emisión. Aunque la tinción ATTO 490LS se conoce por su gran desplazamiento de Stokes (165 nm) bajo excitación de un solo fotón (excitación a 496 nm, emisión a 661 nm), sus propiedades bajo excitación de dos fotones no habían sido caracterizadas, impidiendo su uso en sistemas de un solo láser para imagenología neuronal.

2. Metodología

Los autores emplearon una combinación de análisis espectroscópico y microscopía de dos fotones en cerebros de Drosophila melanogaster ex vivo:

• Modelo Biológico: Se utilizaron moscas transgénicas elav-Gal4 > UAS-TID-Dlg1. El sistema TurboID (TID) se fusionó con la proteína de andamiaje Dlg1 (marcador sináptico) y se expresó en neuronas. Tras alimentar a las moscas con biotina, las proteínas cercanas a Dlg1 se biotinizaron, permitiendo la unión de la tinción ATTO 490LS conjugada con estreptavidina.
• Etiquetado Dúplex: Para probar la capacidad de imagen multicolor, los cerebros se marcaron simultáneamente con:
  1. ATTO 490LS (señal roja, unida a proteínas biotinilizadas).
  2. Un anticuerpo anti-c-Myc seguido de un secundario Alexa Fluor 488 (señal verde, unido a la etiqueta Myc de la proteína TID-Dlg1).
• Análisis Espectral:
  • Escaneo de excitación: Se varió la longitud de onda del láser de 680 nm a 1200 nm en un microscopio Leica TCS SP8 DIVE para identificar los picos de excitación de dos fotones.
  • Escaneo de emisión: Se fijaron longitudes de onda de excitación específicas (780, 920, 940 y 1040 nm) y se midió el espectro de emisión resultante.
• Imagenología: Se utilizaron dos configuraciones de microscopía de dos fotones Thorlabs (modelos A-SCOPE y B-SCOPE) equipadas con un láser de fibra fijo de 920 nm. Se utilizaron dos detectores PMT (tubos fotomultiplicadores) con filtros de banda: uno verde (500–550 nm) y uno rojo (570–640 nm).

3. Contribuciones Clave

• Caracterización Óptica: Se determinó por primera vez que el ATTO 490LS es excitado eficientemente por dos fotones en el rango de 920–940 nm, con un pico de emisión alrededor de 640 nm.
• Validación de Sistema de Un Láser: Se demostró experimentalmente que es posible realizar imágenes dúplex (verde y rojo) utilizando un único láser de 920 nm, eliminando la necesidad de láseres sintonizables costosos o múltiples fuentes láser.
• Protocolo de Etiquetado: Se estableció un protocolo robusto de inmunohistoquímica y marcaje por proximidad (BioID) para visualizar estructuras neuronales específicas en Drosophila con alta resolución.

4. Resultados

• Propiedades de Excitación: El escaneo de excitación reveló tres picos de sensibilidad para ATTO 490LS: 780 nm (máximo global), 940 nm y 1040 nm. Aunque el pico a 780 nm es el más intenso, el pico a 940 nm es altamente relevante porque está muy cerca de la longitud de onda estándar de 920 nm de los láseres comerciales.
• Propiedades de Emisión: Bajo excitación de 920 nm, 940 nm y 1040 nm, el dye emitió consistentemente en un pico de 640 nm. La intensidad de emisión a 920 nm fue menor que a 780 nm, pero suficiente para una detección clara con ganancias de detector bajas.
• Imagen Dúplex Exitosa:
  • Se logró distinguir claramente las señales de Alexa Fluor 488 (verde) y ATTO 490LS (rojo/magenta) simultáneamente.
  • Especificidad Espacial: Se observaron estructuras marcadas exclusivamente con un color (ej. el cuerpo elipsoide marcado solo con ATTO 490LS; los lóbulos γ del cuerpo en hongo marcados solo con Alexa 488) y estructuras doblemente marcadas (lóbulos α y β del cuerpo en hongo).
  • La señal de autofluorescence en el rango de excitación de 920 nm fue mínima en comparación con la señal específica del dye.

5. Significado e Impacto

Este trabajo tiene implicaciones significativas para la neurociencia y la microscopía:

• Accesibilidad Tecnológica: Permite a laboratorios con equipos de microscopía de dos fotones de un solo láser (común en muchos centros) realizar experimentos de imagen multicolor avanzados sin necesidad de actualizaciones costosas de hardware.
• Herramienta para Neurociencia: Facilita la integración de marcadores estructurales estables (rojos) con sensores funcionales verdes (como GCaMP para calcio) en animales vivos o ex vivo. Esto es crucial para correlacionar la estructura neuronal con la actividad funcional.
• Futuras Aplicaciones: Los autores proponen el desarrollo de conjugados de ATTO 490LS para etiquetas genéticas (HaloTag, SNAP-tag), lo que expandiría el conjunto de herramientas para el etiquetado quimiogenético en líneas transgénicas, permitiendo estudios más complejos de circuitos neuronales en animales que se comportan.

En conclusión, el estudio valida al ATTO 490LS como un fluoróforo robusto para la microscopía de dos fotones de un solo láser, superando una barrera técnica importante para la imagenología multicolor en modelos de Drosophila.