From Steady-State to Ultrafast: Resonance Raman Approaches for Biological Samples

जीवन उन अणुओं पर आधारित है जो प्रकाश के साथ नृत्य करते हैं। पौधे की हरी पत्तियों में या फल के लाल मांस में, क्रोमोफोर (chromophores) नामक सूक्ष्म रासायनिक संरचनाएं सूर्य के प्रकाश को अवशोषित करती हैं और इसे ऊर्जा या रंग में परिवर्तित करती हैं। इन अणुओं के काम करने के तरीके को समझने के लिए, वैज्ञानिकों को उनकी आंतरिक संरचना, विशेष रूप से यह देखने की आवश्यकता होती है कि उनके परमाणु कैसे कंपन करते हैं। एक अणु की कल्पना एक जटिल मशीन के रूप में करें; यदि आप इसकी गूँज सुन सकते, तो उस ध्वनि का स्वर और लय आपको ठीक से बता देता कि उसके हिस्से कैसे जुड़े हुए हैं और उनके परिवेश द्वारा उन्हें कैसे दबाया या खींचा जा रहा है। यह वाइब्रेशनल स्पेक्ट्रोस्कोपी (vibrational spectroscopy) का वादा है, एक ऐसी विधि जो इन आणविक गूँजों को सुनती है। हालाँकि, एक जीवित कोशिका में, एक एकल अणु से प्राप्त संकेत आमतौर पर अपने आस-पास की अन्य चीजों—प्रोटीन, पानी और वसा, जो जैविक सूप बनाते हैं—के शोर में दब जाता है। दशकों तक, वैज्ञानिक पृष्ठभूमि के शोर से अभिभूत हुए बिना एक एकल अणु के विशिष्ट गीत को सुनने के लिए संघर्ष करते रहे।

रेजोनेंस रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (Resonance Raman spectroscopy) नामक एक तकनीक ने इस समस्या को एक चयनात्मक श्रवण यंत्र (selective hearing aid) की तरह कार्य करके हल किया। नमूने की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रकाश को उस सटीक रंग के अनुरूप ट्यून करके जिसे एक विशिष्ट अणु पसंद करता है, वैज्ञानिक उस अणु के संकेत को अन्य चीजों को अनदेखा करते हुए लाखों गुना बढ़ा सकते हैं। यह उन्हें एक जटिल प्रोटीन के भीतर एक वर्णक (pigment) की संरचना देखने की अनुमति देता है, भले ही वह प्रोटीन कोशिका झिल्ली के भीतर गहराई में छिपा हो। लेकिन जीवन स्थिर नहीं है; यह घटनाओं की एक तीव्र श्रृंखला है। जब एक पौधा एक फोटॉन को पकड़ता है, तो ऊर्जा प्रणाली के माध्यम से एक झपकी में चलती है, जिससे क्षणों के कुछ हिस्सों में अणुओं का आकार और व्यवहार बदल जाता है। पारंपरिक विधियाँ इन क्षणभंगुर क्षणों को पकड़ने के लिए बहुत धीमी हैं, और उपलब्ध तेज़ विधियों में अक्सर एक ही समय में चल रहे विभिन्न अणुओं के बीच अंतर करने की स्पष्टता की कमी होती है।

एक नए शोध अध्याय में, वैज्ञानिक जुआन जे. रोमेरो, ब्रूनो रॉबर्ट और मैनुअल जे. ल्लांसोला-पोर्टोलेस ने इस शक्तिशाली सुनने की तकनीक को अल्ट्राफास्ट (ultrafast) क्षेत्र में विस्तारित किया है। वे फेमटोसेकंड स्टिम्युलेटेड रेजोनेंस रमन स्पस्पेक्ट्रोस्कोपी (femtosecond stimulated resonance Raman spectroscopy), या FSRRS, नामक एक विधि का वर्णन करते हैं, जो एक हाई-स्पीड कैमरे की गति को रेजोनेंस तकनीक की चयनात्मक श्रवण शक्ति के साथ जोड़ती है। यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को न केवल वास्तविक समय में अणुओं को आकार बदलते देखने की अनुमति देता है, बल्कि यह भी चुनने की अनुमति देता है कि कौन सा अणु बदल रहा है, भले ही कई अलग-अलग प्रजातियां एक साथ प्रतिक्रिया कर रही हों। दूसरे लेजर पल्स के रंग को सावधानीपूर्वक ट्यून करके, टीम एक विशिष्ट उत्तेजित अवस्था (excited state) के कंपन संबंधी हस्ताक्षर को अलग कर सकती है, उसे भीड़ से अलग कर सकती है। यह कार्य प्रकाश संश्लेषण और अन्य जैविक प्रक्रियाओं के क्षणिक यांत्रिकी में एक स्पष्ट खिड़की प्रदान करता है, जो उन विवरणों को प्रकट करता है जो पहले समय और शोर के धुंधलेपन में छिपे हुए थे।

इस कार्य की नींव इस बात को समझने में निहित है कि प्रकाश पदार्थ के साथ कैसे परस्पर क्रिया करता है। जब प्रकाश की एक किरण किसी अणु से टकराती है, तो उसका अधिकांश हिस्सा अपरिवर्तित रहता है, लेकिन एक बहुत छोटा हिस्सा थोड़ा अलग ऊर्जा के साथ बिखर जाता है, क्योंकि उसने अणु के कंपनों के साथ थोड़ी ऊर्जा का आदान-प्रदान किया है। यह रमन स्कैटरिंग (Raman scattering) है। एक सामान्य जैविक नमूने में, यह संकेत अविश्वसनीय रूप से कमजोर होता है और आमतौर पर एक बहुत मजबूत चमक के नीचे दब जाता है जिसे फ्लोरेसेंस (fluorescence) कहा जाता है, जो उन्हीं वर्णकों से आता है। संकेत को दृश्य बनाने के लिए, शोधकर्ता रेजोनेंस का उपयोग करते हैं। जब आने वाले प्रकाश का रंग अणु की ग्राउंड स्टेट (ground state) और एक उत्तेजित अवस्था के बीच के ऊर्जा अंतराल से मेल खाता है, तो अणु बहुत अधिक कुशलता से प्रकाश को बिखेरता है। यह रेजोनेंस प्रभाव एक फिल्टर के रूप में कार्य करता; यह उस विशिष्ट अणु के संकेत को बढ़ाता है जो उस रंग के लिए ट्यून किया गया है, जबकि पृष्ठभूमि में अन्य अणुओं के संकेतों को काफी हदले तक अप्रभावित छोड़ देता है। यही कारण है कि पौधों के वर्णकों के एक जटिल मिश्रण में, वैज्ञानिक केवल लेजर प्रकाश के रंग को बदलकर केवल कैरोटीनॉयड (carotenoids) या केवल क्लोरोफिल (chlorophylls) को देखने का विकल्प चुन सकते हैं।

शोधकर्ताओं ने इस सिद्धांत को उन जैविक नमूनों पर लागू किया जो अध्ययन के लिए कुख्यात रूप से कठिन हैं, जैसे कि पौधों में पाए जाने वाले प्रकाश-संग्रहण परिसर (light-harvesting complexes)। ये परिसर विभिन्न प्रकार के वर्णकों, जिनमें क्लोरोफिल और कैरोटीनॉयड शामिल हैं, से भरे होते हैं, जो आपस में कसकर पैक होते हैं। एक मानक दृश्य में, उनके संकेत ओवरलैप होते हैं, जिससे यह बताना असंभव हो जाता है कि कौन सा वर्णक क्या कर रहा है। रेजोनेंस रमन का उपयोग करते हुए, टीम ने दिखाया कि कैरोटीनॉयड के विशिष्ट अवशोषण बैंड के अनुसार लेजर को ट्यून करके, वे पूरी तरह से कैरोटीनॉयड कंपनों द्वारा प्रधान स्पेक्ट्रम देख सकते थे, जिसमें क्लोरोफिल से कोई हस्तक्षेप नहीं था। इसके विपरीत, क्लोरोफिल बैंड के लिए ट्यून करने पर केवल क्लोरोफिल दिखाई दिए। इस चयनात्मकता ने उन्हें अणुओं में सूक्ष्म परिवर्तन मापने की अनुमति दी। उदाहरण के लिए, उन्होंने पाया कि जिस तरह से एक क्लोरोफिल अणु अपने प्रोटीन साथी द्वारा पकड़ा जाता है, वह उसके आसपास के हाइड्रोजन बॉन्ड की मजबूती को बदल देता है। ये परिवर्तन आणविक कंपनों की आवृत्ति को स्थानांतरित कर देते हैं, जो वर्णक के स्थानीय वातावरण को मापने के लिए एक सटीक पैमाने के रूप में कार्य करते हैं। उन्होंने प्रदर्शित किया कि एक ही प्रोटीन के विभिन्न तैयारियों में थोड़े अलग हाइड्रोजन-बॉन्डिंग पैटर्न हो सकते हैं, जिसने यह समझाया कि प्रोटीन द्वारा प्रकाश अवशोषण में मामूली बदलाव क्यों होते हैं।

हालाँकि, वास्तविक सफलता तब आती है जब यह देखा जाता है कि प्रकाश अवशोषित होने के बाद क्या होता है। प्रकृति में, ऊर्जा का स्थानांतरण फेमटोसेकंड में होता है, एक ऐसा समय पैमाना जो इतना तेज़ है कि एक अकेला फेमटोसेकंड एक सेकंड के मुकाबले उतना ही है जितना एक सेकंड तीस मिलियन वर्षों के मुकाबले है। इसका अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं ने तीन अलग-अलग लेजर पल्स वाली एक पल्स योजना विकसित की। पहला पल्स, एक्टिनिक पंप (actinic pump), अणु को एक उत्तेजित अवस्था में धकेलता है, जिससे प्रतिक्रिया शुरू होती है। एक छोटे, नियंत्रित विलंब के बाद, दूसरा पल्स, रमन पंप (Raman pump), और तीसरा, एक ब्रॉडबैंड प्रोब (broadband probe), अणु के कंपनों का स्नैपशॉट लेने के लिए एक साथ आते हैं। मुख्य नवाचार यह है कि रमन पंप को उत्तेजित अणु के क्षणिक अवशोषण (transient absorption) के रंग से मेल खाने के लिए ट्यून किया जा सकता है। जिस तरह रेजोनेंस ग्राउंड-स्टेट अणुओं के लिए काम करता है, यह इन अल्पकालिक उत्तेजित अवस्थाओं के लिए भी काम करता है। रमन पंप को एक विशिष्ट उत्तेजित अवस्था के साथ रेजोनेंस करने के लिए ट्यून करके, उस अवस्था के संकेत को कई गुना बढ़ाया जा सकता है, जबकि अन्य अवस्थाओं के संकेतों को दबा दिया जाता है।

रमन पंप तरंग दैर्ध्य (wavelength) को ट्यून करने की यह क्षमता प्रयोग में एक नया आयाम जोड़ती है। केवल समय और आवृत्ति को देखने के बजाय, अब शोधकर्ता यह देख सकते हैं कि रमन पंप को विभिन्न रंगों के माध्यम से घुमाने पर स्पेक्ट्रम कैसे बदलता है। एक जटिल प्रणाली में जहाँ कई उत्तेजित अवस्थाएँ एक साथ मौजूद होती हैं, जिनमें से प्रत्येक का अपना अद्वितीय अवशोषण रंग होता है, यह ट्यूनिंग एक चयनकर्ता (selector) के रूप में कार्य करती है। यदि रमन पंप को एक ऐसे रंग पर सेट किया जाता है जो एक उत्तेजित अवस्था से मेल खाता है, तो उस अवस्था का कंपन संबंधी फिंगरप्रिंट स्पष्ट और सुस्पष्ट हो जाता है। यदि पंप को दूसरे रंग पर ट्यून किया जाता है, तो एक अलग अवस्था दृश्यमान हो जाती है। शोधकर्ताओं ने इसका परीक्षण लाइकोपीन (lycopene) पर किया, जो टमाटर में पाया जाने वाला एक लाल वर्णक है, जिसमें कई डार्क उत्तेजित अवस्थाएँ होती हैं जिन्हें पहचानना कठिन होता है। रमन पंप को विभिन्न तरंग दैर्ध्य के माध्यम से स्टेप-बाय-स्टेप चलाकर, वे चार अलग-अलग उत्तेजित अवस्थाओं के कंपन संकेतों को अलग करने में सक्षम थे जो पहले अविभाज्य थे। वे देख सके कि पंप रंग के साथ उनकी तीव्रता कैसे बदलती है, इसके आधार पर कुछ कंपन एक अवस्था के थे, जबकि अन्य दूसरी अवस्था के थे।

पेपर इस बात पर जोर देता है कि यह विधि केवल एक सैद्धांतिक सुधार नहीं है बल्कि जैविक फोटोफिजिक्स (biological photophysics) को समझने के लिए एक व्यावहारिक आवश्यकता है। प्रकाश-संग्रहण एंटेना जैसे सिस्टम में, जहाँ ऊर्जा को गर्मी के रूप में नष्ट होने से पहले कुशलतापूर्वक स्थानांतरित किया जाना चाहिए, विशिष्ट पथ इस बात पर निर्भर करता है कि कौन सी उत्तेजित अवस्था सक्रिय है। इन अवस्थाओं को अलग करने की क्षमता के बिना, वैज्ञानिक केवल अनुमान लगा सकते थे कि किसी विशेष जैविक कार्य में कौन सी अवस्था शामिल थी। नई तकनीक उन्हें विशिष्ट अवस्थाओं, जैसे कि सिंगलेट स्टेट (singlet state), ट्रिपलेट पेयर (triplet pair), या चार्ज-ट्रांसफर स्टेट्स (charge-transfer states) को विशिष्ट कंपन मार्करों को सौंपने की अनुमति देती है। विवरण का यह स्तर यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि पौधे अतिरिक्त प्रकाश से खुद को कैसे बचाते हैं या वे लगभग पूर्ण दक्षता के साथ ऊर्जा कैसे स्थानांतरित करते हैं। शोधकर्ताओं ने यह भी नोट किया कि हालांकि यह तकनीक शक्तिशाली है, इसके लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। चूंकि लेजर पल्स बहुत तीव्र होते हैं और अणु बहुत संवेदनशील होते हैं, इसलिए नुकसान से बचने के लिए नमूने को लगातार रिफ्रेश किया जाना चाहिए, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि संकेतों को सही ढंग से कैप्चर किया जाए कि तीनों लेजर बीम का संरेखण (alignment) एकदम सटीक होना चाहिए।

अंततः, यह कार्य जीवन की आणविक मशीनरी को क्रिया में देखने की हमारी क्षमता में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। फेमटोसेकंड लेजर की गति को रेजोनेंस की रासायनिक चयनात्मकता के साथ जोड़कर, शोधकर्ताओं ने एक ऐसा उपकरण बनाया है जो एक जैविक प्रतिक्रिया के घटित होने के दौरान उसके हृदय में झांक सकता है। उन्होंने दिखाया है कि प्रोब लाइट के रंग को एक चर (variable) के रूप में मानकर, वे परस्पर क्रिया करने वाले अणुओं के जटिल जाल को सुलझा सकते हैं जो प्रकाश संश्लेषण को संचालित करते हैं। परिणाम पुष्टि करते हैं कि इन अणुओं की कंपन संरचना उनकी इलेक्ट्रॉनिक अवस्था और उनके परिवेश के आधार पर अनुमानित तरीकों से बदलती है। यह दृष्टिकोण केवल एक स्नैपशॉट प्रदान नहीं करता है; यह आणविक नृत्य का एक मूवी प्रदान करता है, जहाँ हर कदम स्पष्ट रूप से पहचाना जाता है और हर साथी ज्ञात होता है। जैसा कि लेखक कहते हैं, यह विधि प्रकाश-संग्रहण परिसरों से लेकर तनाव-संबंधी प्रोटीनों तक, जैविक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने का द्वार खोलती है, जो यह समझने के रहस्यों को सुलझाने का एक नया तरीका प्रदान करती है कि जीवन प्रकाश को कैसे पकड़ता है और उपयोग करता है।