Quantal PCR: A Calibrator-Free Method for Determining the Unit for Nucleic Acid Quantification

कल्पना कीजिए कि आप एक विशाल, अदृश्य जार में बीजों की संख्या गिनने की कोशिश कर रहे हैं। आमतौर पर, ऐसा करने के लिए, आपको अपने रहस्यमय जार की तुलना करने के लिए एक "मानक जार" (standard jar) की आवश्यकता होगी जिसमें बीजों की ज्ञात संख्या हो। यदि आपका मानक जार थोड़ा भी गलत है, तो आपके रहस्यमय जार की गिनती भी गलत होगी। यह DNA गिनने के वर्तमान स्वर्ण मानक (gold standard), जिसे qPCR कहा जाता है, के साथ होने वाली समस्या है। यह इन "मानक जारों" (कैलिब्रेटर्स) पर निर्भर करता है, जो असंगत हो सकते हैं और त्रुटियों का कारण बन सकते हैं।

यह शोध पत्र एक नई विधि पेश करता है जिसे क्वांटल पीसीआर (quPCR) कहा जाता है, जो उन मानक जारों को पूरी तरह से त्याग देती है। किसी बाहरी पैमाने से अपने DNA की तुलना करने के बजाय, यह अपने स्वयं के पैमाने को अंदर से बाहर की ओर बनाता है।

यह कैसे काम करता है, इसके लिए एक सरल उपमा (analogy) देखें:

"सिक्का उछालने" की उपमा

DNA रेप्लिकेशन (प्रतिलिपिकरण) को सिक्के उछालने के एक विशाल खेल की तरह समझें।

• पुराना तरीका: आपके पास कितने सिक्के हैं, इसका अनुमान लगाने के लिए, आप अपने मित्र के सिक्कों के ज्ञात ढेर से अपनी तुलना करते हैं। यदि आपके मित्र का ढेर अव्यवset है, तो आपका अनुमान गलत होगा।
• नया तरीका (quPCR): आप किसी और को नहीं देखते। इसके बजाय, आप देखते हैं कि सिक्के उछालने पर वे कैसे व्यवहार करते हैं।

वैज्ञानिकों ने महसूस किया कि DNA रेप्लिकेशन का एक स्वाभाविक "व्यक्तित्व" या संभावना होती है। जब बहुत अधिक DNA होता है, तो सिस्टम एक अनुमानित, कुशल तरीके से व्यवहार करता है। नई विधि पहले इस दक्षता (efficiency) को मापती है। यह बिल्कुल वैसा ही है जैसे यह जानना कि आपका सिक्का वास्तव में कितना भारी है और उसके 'हेड्स' आने की कितनी संभावना है।

मानचित्र बनाना

एक बार जब वे "खेल के नियमों" (दक्षता) को जान लेते हैं, तो वे गणित का उपयोग यह अनुमान लगाने के लिए करते हैं कि यदि उनके पास अलग-अलग मात्रा में DNA होता तो परिणाम कैसे दिखने चाहिए। वे एक संभाव्यता मानचित्र (probability map) या वितरण प्रोफ़ाइल बनाते है जो यह दिखाता है कि किसी भी समय परिणाम प्राप्त होने की क्या संभावना है।

फिर, वे लिमिटिंग डाइल्यूशन (limiting dilution) नामक एक विशेष परीक्षण करते हैं। कल्पना कीजिए कि आप अपने DNA को तब तक पतला (dilute) करते हैं जब तक कि आपके पास बहुत कम मात्रा रह जाए, जिससे कभी आपके पास शून्य बीज होते हैं, और कभी केवल एक। अपने इस "लगभग खाली" परीक्षण के वास्तविक परिणामों की उनके सैद्धांतिक संभाव्यता मानचित्र के विरुद्ध तुलना करके, वे उस सटीक क्षण का पता लगा सकते हैं जब एक एकल DNA अणु रेप्लिकेशन शुरू करता है।

"जादुई संख्या" (quCq)

इस सटीक क्षण को quCq कहा जाता है। इसे उस "जादुई संख्या" के रूप में सोचें जो रेप्लिकेशन की पूर्ण न्यूनतम इकाई का प्रतिनिधित्व करती है। क्योंकि यह संख्या भौतिकी और रसायन विज्ञान (ऊष्मागतिकी और गतिकी) के नियमों से प्राप्त होती है न कि किसी मानव-निर्मित मानक से, इसलिए यह एक आंतरिक इकाई (intrinsic unit) है। यह एक "मीटर" को प्रकाश की गति के आधार पर परिभाषित करने जैसा है, न कि उस धातु की छड़ के आधार पर जो किसी तहखाने में सिकुड़ या फैल सकती है।

प्रमाण

यह सिद्ध करने के लिए कि यह काम कर गया, शोधकर्ताओं ने एक DNA नमूने का परीक्षण किया जिसमें दो अलग-अलग "लक्ष्य" (जैसे एक ही जार में दो अलग-अलग प्रकार के बीज) थे। उन्होंने उन्हें गिनने के लिए दो अलग-अलग नियमों के सेट का उपयोग किया। भले ही नियम अलग थे, लेकिन दोनों विधियों ने उन्हें प्रतियों (copies) की सटीक समान संख्या दी।

मुख्य निष्कर्ष

यह शोध पत्र दावा करता है कि क्वांटल पीसीआर (Quantal PCR) बिना किसी बाहरी मानक या "कैलिब्रेटर" के DNA अणुओं को पूर्ण और सटीक रूप से गिनने का एक तरीका है। यह DNA को स्वयं के पैमाने में बदल देता है, जिससे वैज्ञानिक एक नए प्रकार की निश्चितता के साथ सिंगल-मॉलिक्यूल स्तर तक गणना कर सकते हैं।