Improved adenine-HPLC method for quantifying yeast based on cellular DNA content

कल्पना कीजिए कि आप एक भीड़ भरे स्टेडियम में लोगों की संख्या गिनने की कोशिश कर रहे हैं। आमतौर पर, आप सिर गिनने की कोशिश कर सकते हैं, लेकिन क्या होगा यदि कुछ लोग आपस में बहुत करीब होकर गुच्छों में खड़े हों, या यदि भीड़ इतनी तेज़ी से चल रही हो कि स्पष्ट रूप से देख पाना कठिन हो? यह वह समस्या है जिसका सामना वैज्ञानिक फंगस (यीस्ट) जैसे सूक्ष्म जीवों को गिनने के दौरान करते हैं। पारंपरिक गिनती के तरीके अक्सर गुच्छों या अजीब आकारों के कारण भ्रमित हो जाते हैं।

कुछ साल पहले, शोधकर्ताओं ने बैक्टीरिया के लिए इसे हल करने के लिए एक चतुर नई तकनीक खोजी, जिसे "एडेनिन-HPLC विधि" (Adenine-HPLC Method) कहा जाता है। इस विधि को एक "DNA फिंगरप्रिंट स्कैनर" के रूप में समझें। पूरे सेल (कोशिका) को गिनने के बजाय, यह एक विशिष्ट रासायनिक घटक को खोजता है जिसे "एडेनिन" कहा जाता है, जो कोशिका के DNA के भीतर बंद होता है। चूंकि प्रत्येक बैक्टीरिया में इस घटक की एक अनुमानित मात्रा होती है, इसलिए मशीन कोशिकाओं को एडेनिन की कुल मात्रा को मापकर गिन सकती है, भले ही बैक्टीरिया एक बड़े गोले के रूप में आपस में चिपके हुए हों।

समस्या: यीस्ट का "रिसाव" (The Yeast "Leak")
जब वैज्ञानिकों ने इसी तकनीक को यीस्ट (एक प्रकार का फंगस) पर आज़माने की कोशिश की, तो यह काम नहीं कर पाई। यह ऐसा था जैसे एक स्टेडियम में लोगों को गिनने की कोशिश करना, लेकिन स्टेडियम की छत से पानी भी रिस रहा हो, और वह पानी उस बारिश के साथ मिल रहा हो जिसे आप मापने की कोशिश कर रहे थे।

क्यों? क्योंकि यीस्ट कोशिकाएं अव्यवस्थित होती हैं। वे एडेनिन को केवल अपने DNA में ही नहीं रखतीं; वे इसे अन्य स्थानों पर भी संचित करती हैं, जैसे कि RNA (DNA का एक संबंधी) और ATP (कोशिका की ऊर्जा बैटरी)। जब वैज्ञानिकों ने DNA प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को तोड़ने की कोशिश की, तो उन्होंने अनजाने में इन अन्य कंटेनरों को भी तोड़ दिया। मशीन ने अंततः सारा एडेनिन—DNA, RNA और ऊर्जा सबको मिलाकर—माप लिया, जिससे अंतिम गणना बेहद गलत हो गई। यह बिल्कुल वैसा ही था जैसे किसी जार में रखे सोने के सिक्कों को गिनने की कोशिश करना, लेकिन जार तांबे के सिक्कों से भी भरा हो जो स्कैनर के सामने बिल्कुल एक जैसे दिख रहे हों।

समाधान: एक बेहतर, स्वच्छ दृष्टिकोण
इसे ठीक करने के लिए, टीम ने तीन स्मार्ट बदलावों के साथ एक "सुधारित एडेनिन-HPLC विधि" (Improved Adenine-HPLC Method) विकसित की:

1. "धीमी फ्रीज" (तापमान नियंत्रण): कोशिकाओं को तोड़ने के लिए एक गर्म और आक्रामक एसिड का उपयोग करने के बजाय (जो सब कुछ चकनाचूर कर देता है), उन्होंने एक ठंडे और सौम्य एसिड का उपयोग किया। कल्पना कीजिए कि आप एक बंद बक्से को खोलने की कोशिश कर रहे हैं। पुराना तरीका बक्से और उसके अंदर की हर चीज़ को हथौड़े से तोड़ने का था। नया तरीका ताले को सावधानी से खोलना है। यह कोमल दृष्टिकोण DNA के कंटेनर को तो तोड़ देता है लेकिन RNA और ATP के कंटेनरों को कसकर बंद रखता है, ताकि उनका एडेनिन बाहर न निकल सके।
2. "प्री-वॉश" (जार की सफाई): कोशिकाओं को तोड़ने से पहले, उन्होंने यीस्ट को एक त्वरित धुलाई दी। यह जार के बाहरी हिस्से को धोने जैसा है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सतह पर कोई भी अतिरिक्त सिक्के चिपके हुए न हों जो बाद में गिनती को बिगाड़ सकें।
3. "बैकग्राउंड चेक" (शोर को घटाना): बेहतरीन सफाई के बावजूद, थोड़ा बहुत मुक्त-तैरता हुआ एडेनिन स्वाभाविक रूप से मौजूद रहता है। नई विधि में इस "बैकग्राउंड नॉइज़" (पृष्ठभूमि के शोर) को मापने और इसे अंतिम कुल योग से घटाने का एक चरण शामिल है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि वे केवल उसी एडेनिन को गिन रहे हैं जो वास्तव में DNA से आया है।

परिणाम
इन सुधारों के साथ, वैज्ञानिक अब यीस्ट कोशिकाओं को अविश्वसनीय सटीकता के साथ गिन सकते हैं, चाहे वे एकल कोशिकाएं हों या गुच्छों के रूप में एक गेंद की तरह हों। उन्होंने एक अव्यवस्थित और भ्रमित करने वाली माप को एक सटीक "DNA जनगणना" में बदल दिया है, जिससे उन्हें यह जानने में मदद मिलती है कि नमूने में वास्तव में कितने यीस्ट जीनोम मौजूद हैं। यह उन सभी के लिए एक बड़ी जीत है जो यीस्ट के साथ काम करते हैं, चाहे वे बीयर बनाने वाले ब्रुअर्स हों या नई दवाएं विकसित करने वाले वैज्ञानिक।