A genetic toolkit for stable transgenesis in the anaerobic gut parasite Blastocystis ST7-B
यह अध्ययन अवायवीय आंत परजीवी *Blastocystis* ST7-B के लिए एक व्यापक आनुवंशिक टूलकिट स्थापित करता है, जिसमें अनुकूलित इलेक्ट्रोपोरेशन, प्रमाणित एंटीबायोटिक चयन प्रणाली और विविध रिपोर्टर क्षमताओं वाले स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों को उत्पन्न करने के लिए एक तीन-चरणीय वर्कफ़्लो शामिल है, जिससे इस प्रचलित मानव सूक्ष्मजीव के कार्यात्मक जेनेटिक्स में पिछली बाधाओं को दूर किया जा सकता है।
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मानव आंत की कल्पना एक हलचल भरे, भीड़भाड़ वाले शहर के रूप में करें जहाँ खरबों नन्हे किरायेदार रहते हैं। इनमें से अधिकांश किरायेदार बैक्टीरिया हैं, लेकिन कुछ एककोशिकीय यूकेरियोट्स (eukaryotes) भी हैं—ऐसे जीव जिनकी आंतरिक संरचना जटिल होती है, जैसे कि एक छोटा कारखाना जिसमें एक मैनेजर का कार्यालय (केंद्रक/nucleus) हो। इस शहर के सबसे आम निवासियों में से एक ब्लास्टोसिस्टिस (Blastocystis) नामक एक परजीवी है। लंबे समय तक, वैज्ञानिक इस शहर में जासूसों की तरह एक रहस्य सुलझाने की कोशिश कर रहे थे, लेकिन वे अटक गए थे क्योंकि वे किरायेदारों के अपार्टमेंट के अंदर जाकर यह नहीं देख पा रहे थे कि वे कैसे काम करते हैं। विज्ञान की दुनिया में, "ट्रांसजेनेसिस" (transgenesis) इन नन्हे किरायेदारों को निर्देशों का एक नया सेट (एक जीन) देने जैसा है ताकि देखा जा सके कि क्या होता है। आमतौर पर, वैज्ञानिक ऐसा करने के लिए एक "जेनेटिक टूलकिट" का उपयोग करते हैं, लेकिन ब्लास्टोसिस्टिस के लिए दरवाजे मजबूती से बंद थे। बड़ा सवाल यह था: हम इन विशिष्ट निर्देशों को अंदर कैसे पहुँचाएँ, यह कैसे सुनिश्चित करें कि किरायेदार उन्हें अपने पास रखे, और बिना किरायेदार को मारे उन्हें काम करते हुए कैसे देखें?
यह शोध पत्र अंततः उस ताले को खोलने के बारे में है। शोधकर्ताओं ने ब्लास्टोसिस्टिस के एक संस्करण, जिसे ST7-B के रूप में जाना जाता है, के लिए विशेष रूप से एक नया "जेनेटिक टूलकिट" बनाया है। इस टूलकिट को एक मास्टर कुंजी के रूप में समझें जो अंततः वैज्ञानिकों को इन परजीवियों में नए जीन डालने और उन्हें वहाँ बनाए रखने की अनुमति देती है। उन्होंने केवल अनुमान नहीं लगाया कि इसे कैसे करना है; उन्होंने सबसे अच्छे "ऑन-स्विच" (प्रमोटर/promoters) और "ऑफ-स्विच" (टर्मिनेटर/terminators) खोजने के लिए परजीवी के अपने तंत्र के विभिन्न हिस्सों का परीक्षण किया। उन्होंने इन स्विचों का परीक्षण करने के लिए NanoLuc नामक एक बहुत ही चमकीली, नन्ही रोशनी का उपयोग किया, और उन्हें चार श्रेणियों में वर्गीकृत किया: वे जो देखने के लिए बहुत धुंधले थे, कमजोर, मध्यम और मजबूत।
जीनों को अंदर पहुँचाने के लिए, उन्हें बिजली (इलेक्ट्रोपोरेशन/electroporation) के माध्यम से परजीवियों को झटकने का सही तरीका पता लगाना था, बिना उन्हें जलाए। उन्होंने एक "स्वीट स्पॉट" (सही संतुलन) खोजा जहाँ बिजली इतनी शक्तिशाली थी कि दरवाजा खोल सके लेकिन इतनी कोमल भी थी कि परजीवी जीवित रह सके। एक बार अंदर जाने के बाद, उन्हें यह सुनिश्चित करने के लिए एक तरीका चाहिए था कि केवल वे परजीवी ही जीवित रहें जिन्होंने नए जीन स्वीकार किए हैं। उन्होंने विभिन्न "सुरक्षा गार्डों" (एंटीबायोटिक्स) का परीक्षण किया और पाया कि अनचाहे मेहमानों को बाहर रखने और संशोधित जीवों को रहने देने के लिए प्यूरोमाइसिन (puromycin) और ट्राइमेथोप्रिम (trimethoprim) सबसे अच्छे थे।
इसके बाद शोधकर्ताओं ने इन नए, संशोधित परजीवियों को उगाने के लिए एक तीन-चरणीय असेंबली लाइन बनाई: पहले, उन्होंने उन्हें एक तरल सूप में बढ़ने दिया; फिर, वे उन्हें अलग-अलग कॉलोनियों (विकास के छोटे द्वीपों की तरह) के निर्माण के लिए एक ठोस सतह पर ले गए; और अंत में, उन्होंने इन कॉलोनियों को वापस तरल कल्चर में विस्तारित किया। सबसे अच्छी बात क्या है? उन्होंने दिखाया कि इन कॉलोनियों को फ्रीज किया जा सकता है, पिघलाया जा सकता है, और बाद में पुनर्जीवित किया जा सकता है, और वे अभी भी अपने नए जीन और एंटीबायोटिक प्रतिरोध को बनाए रखते हैं।
अंत में, उन्होंने P2A नामक एक विशेष पेप्टाइड का उपयोग करके एक चतुर तकनीक जिसे "बाइसिस्ट्रोनिक कंस्ट्रक्ट" (bicistronic construct) कहा जाता है, का प्रयास किया। इसे एक दो-इन-एक टिकट के रूप में समझें: यदि परजीवी टिकट स्वीकार करता है, तो उसे सुरक्षा मंजूरी (एंटीबायोटिक प्रतिरोध) और एक विशेष चमकता हुआ बैज (एक रिपोर्टर प्रोटीन जैसे UnaG, smURFP, या SNAP-tag) दोनों मिलते हैं। अध्ययन से पता चला कि इन बैजों का चमकना विशिष्ट बैज और इस बात पर निर्भर करता था कि क्या परजीवी के पास चमकने के लिए सही सामग्री है। यह टूलकिट केवल दरवाजा ही नहीं खोलता; यह वैज्ञानिकों को इन परजीवियों को अपने लैब में आमंत्रित करने, उन्हें संशोधित करने और उन तरीकों से अध्ययन करने का एक विश्वसनीय तरीका देता है जो पहले असंभव थे।
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