Isolation and In vitro Characterization of BchE, the Cobalamin-Dependent Anaerobic Magnesium Protoporphyrin IX Monomethylester Cyclase Involved in Bacteriochlorophyll Biosynthesis

जीवन की अदृश्य कार्यशाला

कल्पना कीजिए कि एक जीवित कोशिका के भीतर एक हलचल भरी, उच्च-तकनीकी फैक्ट्री है। इस फैक्ट्री में, एंजाइम नामक नन्हे मशीनें लगातार काम में जुटी रहती हैं, जो उन जटिल अणुओं का निर्माण करती हैं जो जीवन को चलाए रखते हैं। इनमें से कुछ मशीनें मास्टर शेफ की तरह हैं, जो भोजन बनाने के लिए सामग्रियों को आपस में जोड़ती हैं; अन्य निर्माण कर्मियों की तरह हैं, जो मजबूत दीवारें बनाती हैं। लेकिन एंजाइमों का एक विशेष वर्ग है जो कीमियागरों (alchemists) की तरह काम करता है। वे केवल चीजों को मिलाते नहीं हैं; वे इलेक्ट्रॉनों के साथ जादू के करतब दिखाते हैं, परमाणुओं को पुनर्व्यवस्थित करते हैं ताकि पूरी तरह से नए आकार और संरचनाएं बनाई जा सकें जिनकी प्रकृति को जीवित रहने के लिए आवश्यकता होती है।

इन कीमियागरों द्वारा बनाई जाने वाली सबसे महत्वपूर्ण चीजों में से एक क्लोरोफिल (chlorophylls) नामक पिगमेंट का परिवार है। जबकि आपके पिछवाड़े के पौधों में मौजूद हरा क्लोरोफिल उन्हें सूरज की रोशनी सोखने में मदद करता है, बैक्टीरियोक्लोरोफिल (bacteriochlorophyll) नामक एक अलग 'कजिन' कुछ बैक्टीरिया को अंधेरे, गहरे भूमिगत स्थानों या मटमैले पानी में पनपने की अनुमति देता है। इस विशेष पिगमेंट को बनाने के लिए, बैक्टीरिया को एक बहुत ही कठिन रासायनिक करतब दिखाना पड़ता है: उन्हें एक चपटे, वलय (ring) के आकार के अणु को एक नए, पांचवें वलय में मोड़ने के लिए मजबूर करना होता है, और साथ ही एक विशिष्ट ऑक्सीजन परमाणु भी जोड़ना होता है। समस्या यह है कि यह करतब बिना हवा में मौजूद ऑक्सीजन की मदद के करना होगा—क्योंकि ये बैक्टीरिया ऑक्सीजन-मुक्त क्षेत्रों में रहते हैं। दशकों तक, वैज्ञानिकों को पता था कि BchE नामक एक विशिष्ट एंजाइम वह जादू कर रहा है, लेकिन कोई भी इसे काम करते हुए पकड़ नहीं सका। यह ऐसा था जैसे यह जानना कि एक जादूगर मौजूद है, लेकिन कभी उसका जादू न देख पाना क्योंकि जादूगर मंच पर आने से इनकार कर देता था।

महान पलायन और लापता वलय का रहस्य

यह शोध पत्र अंततः उस मायावी जादूगर, BchE को पकड़ने और उसे पहली बार एक टेस्ट ट्यूब में अपना जादू दिखाते हुए देखने की कहानी है। वर्षों से, BchE को एक "रेडिकल SAM" एंजाइम के रूप में जाना जाता था—जो एक विशेष आयरन-सल्फर क्लस्टर (इसे एक छोटी, जंग लगी बैटरी की तरह समझें) और एक विटामिन B12 जैसे सहायक (कोबालमीन) का उपयोग करके एक श्रृंखला अभिक्रिया शुरू करने वाली मशीन का एक फैंसी नाम है। लक्ष्य MPE नामक अणु को प्रोटोक्लोरोफिलिड (PChlide) में बदलना था, जो बैक्टीरियोक्लोरोफिल बनाने में एक प्रमुख कदम है। बड़ा रहस्य यह था कि यह कैसे करता है। क्या इसने अपने विटामिन सहायक के एक विशिष्ट संस्करण का उपयोग किया? क्या इसने नया वलय एक बड़ी छलांग में बनाया या छोटे चरणों की एक श्रृंखला में?

शोधकर्ता, निकोलस यॉर्क और स्क्वायर बुकर के नेतृत्व में, एक बड़ी बाधा का सामना कर रहे थे: BchE स्वभाव से बहुत जिद्दी था। यह पानी में नहीं घुलता था, जिससे लैब में इसका अध्ययन करना असंभव हो गया था। यह एक ऐसी मछली का अध्ययन करने की कोशिश करने जैसा था जो केवल दलदल में रहती है और जैसे ही आप उसे बाहर निकालने की कोशिश करते हैं, वह पत्थर बन जाती है। इस समस्या को हल करने के लिए, टीम ने "टैग" का एक चतुर खेल खेला। उन्होंने BchE के साथ एक बड़ा, अनुकूल प्रोटीन (जिसे MBP कहा जाता है) जोड़ा, जो एक हैंडल की तरह काम करता है जिससे वह जिद्दी एंजाइम घुलनशील और पकड़ने में आसान हो गया। उन्होंने एंजाइम बनाने वाले बैक्टीरिया को भी इंजीनियर किया ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि उसके पास सही उपकरण (आयरन और कोबालमीन) हों। बहुत अधिक प्रयास और त्रुटियों के बाद, उन्होंने सफलतापूर्वक एंजाइम को शुद्ध किया, और वह काम करने के लिए तैयार था।

प्रदर्शन: एंजाइम ने वास्तव में क्या किया

जब टीम ने अंततः टेस्ट ट्यूब में BchE को काम करते हुए पाया, तो उन्होंने जादू होते देखा। एंजाइम ने सफलतापूर्वक चपटे MPE अणु को PChlide में बदल दिया, जिससे उस पांचवें वलय को बनाने का कठिन कार्य पूरा हुआ। लेकिन असली रोमांच बीच के चरणों को देखने में आया।

वैज्ञानिकों ने पाया कि एंजाइम ने वलय को तुरंत बंद नहीं कर दिया। इसके बजाय, इसने उत्पाद को चरणों में बनाया। पहले, इसने एक ऑक्सीजन परमाणु जोड़ा ताकि "हाइड्रॉक्सी-MPE" मध्यवर्ती (एक अणु जिसमें अल्कोहल समूह होता है) बनाया जा सके। फिर, इसने इसे और अधिक ऑक्सीकृत किया ताकि "केटो-MPE" मध्यवर्ती (एक अणु जिसमें कीटोन समूह होता है) बनाया जा सके। अंत में, इसने अणु को एक वलय में मोड़ दिया ताकि अंतिम उत्पाद बनाया जा सके। वे इन मध्यवर्ती चरणों को काम करते हुए पकड़ने में सक्षम थे, जिससे पुष्टि हुई कि यह अभिक्रिया एक चरण-दर-चरण तरीके से होती है, ठीक वैसे ही जैसे एक समय में एक सीढ़ी चढ़ना।

हालाँकि, प्रयोग ने कुछ अप्रत्याशित "ऑफ-पाथवे" (मार्ग से भटकने वाले) उत्पादों का भी खुलासा किया। जब शोधकर्ताओं ने एंजाइम को चलाने के लिए एक बहुत ही शक्तिशाली रासायनिक रिड्यूसर (Ti(III)citrate) का उपयोग किया, तो उन्होंने एक अजीब उप-उत्पाद (byproduct) बनते देखा। यह उप-उत्पाद, जिसे टीम इसके द्रव्यमान के कारण "575 प्रजाति" कहती है, शुरुआती सामग्री जैसा दिखता था लेकिन इसमें से दो हाइड्रोजन परमाणु निकल गए थे, जिससे एक डबल बॉन्ड (ओलेफिन) बन गया था। यह एक ऐसी कार की तरह था जिसे फिनिश लाइन तक जाना था, लेकिन इसके बजाय वह गड्ढे में फंस गई और साइकिल बन गई। टीम ने इस "साइकिल" का परीक्षण किया, इसे अभिक्रिया से बाहर निकाला और इसे वापस एंजाइम में डालने की कोशिश की, इस उम्मीद में कि एंजाइम इसे ठीक कर देगा। यह काम नहीं आया। एंजाइम उस "साइकिल" को वापस "कार" में नहीं बदल सका। इससे पता चलता है कि 575 प्रजाति एक मृत-अंत (dead-end) वाली गलती है, एक शंट उत्पाद जो एंजाइम तब बनाता है जब स्थितियाँ बिल्कुल सही नहीं होती हैं, न कि प्रक्रिया का एक आवश्यक चरण।

पुराने सिद्धांतों को खारिज करना

इस शोध पत्र के सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक भ्रम को दूर करना था कि एंजाइम कैसे काम करता है। लंबे समय से, वैज्ञानिकों को लगा था कि एंजाइम को अभिक्रिया शुरू करने के लिए अपने विटामिन सहायक के एक विशिष्ट रूप, जिसे AdoCbl कहा जाता है, की आवश्यकता हो सकती है, जैसा कि कुछ अन्य एंजाइमों के मामले में होता है। शोधकर्ताओं ने बिना किसी AdoCbl के एंजाइम बनाकर इसका परीक्षण किया और देखा कि क्या यह अभी भी काम करता है। यह काम कर गया। वास्तव में, जब उन्होंने एंजाइम को AdoCbl का उपयोग करने के लिए मजबूर किया, तो इसने वास्तव में अभिक्रिया को धीमा कर दिया। यह दृढ़ता से सुझाव देता है कि AdoCbl सक्रिय सहायक नहीं है; एंजाइम अपने दूसरे प्रकार के कोबालमीन के साथ भी ठीक से काम करता है।

उन्होंने यह भी परीक्षण किया कि क्या एंजाइम एक "मिथाइलेज" (एक मशीन जो मिथाइल समूह जोड़ती है) की तरह कार्य करता है। उन्होंने पाया कि जब उनके विटामिन सहायक का मिथाइलेशन (MeCbl में परिवर्तन) हुआ, तो अभिक्रिया रुक गई। इसने पुष्टि की कि BCh E एक मिथाइलेज नहीं है; यह पूरी तरह से एक अलग तरह की मशीन है, जो अपने विटामिन सहायक का उपयोग वलय बनाने के लिए करती है, न कि मिथाइल समूह जोड़ने के लिए।

सहायकों की भूमिका

टीम ने यह भी खोजा कि एंजाइम अपने "ईंधन" के प्रकार को लेकर बहुत चयनात्मक है। जब उन्होंने मजबूत रासायनिक ईंधनों का उपयोग किया, तो एंजाइम तेजी से काम करता था लेकिन बहुत सारी गलतियाँ (जैसे 575 प्रजाति और मिथाइलेटेड विटामिन) करता था। हालाँकि, जब उन्होंने प्रकृति में पाए जाने वाले जैविक ईंधनों का उपयोग किया—विशेष रूप से फेरेडॉक्सिन (ferredoxins) नामक प्रोटीन—तो एंजाइम बहुत धीरे काम करता था लेकिन बहुत सटीक रूप से काम करता था। इसने बिना किसी बड़ी गलती के अंतिम उत्पाद बनाया। यह सुझाव देता है कि वास्तविक दुनिया में, इन बैक्टीरिया के भीतर, एंजाइम संभवतः इन प्राकृतिक प्रोटीनों का उपयोग करके अभिक्रिया को सटीक और कुशल बनाए रखता है।

ऑक्सीजन का प्रश्न

अंत में, इस शोध पत्र ने इस बहस को सुलझा दिया कि अंतिम उत्पाद में ऑक्सीजन परमाणु कहाँ से आता है। चूंकि बैक्टीरिया ऑक्सीजन-मुक्त वातावरण में रहते हैं, इसलिए यह एक रहस्य था कि एंजाइम अणु में ऑक्सीजन परमाणु कैसे जोड़ सकता है। शोधकर्ताओं ने पानी में इस अभिक्रिया को चलाकर इसका परीक्षण किया जहाँ ऑक्सीजन के परमाणु एक भारी, दुर्लभ संस्करण (ऑक्सीजन-18) थे। उन्होंने पाया कि अंतिम उत्पाद में यह भारी ऑक्सीजन मौजूद था। इसने साबित कर दिया कि एंजाइम ऑक्सीजन परमाणु को सीधे एक पानी के अणु से चुराता है, न कि हवा से। यह एक चतुर चाल है: एंजाइम अपनी संरचना बनाने के लिए पानी का उपयोग ऑक्सीजन के स्रोत के रूप में करता है, भले ही वह ऐसी जगह रहता हो जहाँ हवा नहीं है।

बड़ी तस्वीर

संक्षेप में, यह शोध पत्र एक बड़ी सफलता है क्योंकि इसने अंततः वैज्ञानिकों को BChE एंजाइम को क्रिया में देखने की अनुमति दी। उन्होंने सिद्ध किया कि यह चरण-दर-चरण तरीके से बैक्टीरियोक्लोरोफिल रिंग बनाता है, ऑक्सीजन के स्रोत के रूप में पानी का उपयोग करता है और एक विशिष्ट प्रकार के कोबालमीन को सहायक के रूप में उपयोग करता है। उन्होंने इस विचार को खारिज कर दिया कि इसे AdoCbl की आवश्यकता है या यह एक मिथाइलेज के रूप में कार्य करता है। उन्होंने एक "डेड-एंड" गलती वाले उत्पाद (575 प्रजाति) की भी पहचान की, जो तब बनता है जब अभिक्रिया की स्थितियाँ बहुत कठोर होती हैं। हालांकि वलय बंद होने के सटीक परमाणु-स्तर के नृत्य को अभी भी समझा जा रहा है, यह कार्य मशीनरी का पहला ठोस, स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है, जो दशकों पुराने रहस्य को एक सुल्झने वाली पहेली में बदल देता है। यह हमें दिखाता है कि इन बैक्टीरिया की अंधेरी, ऑक्सीजन-रहित दुनिया में भी, प्रकृति ने जीवन के लिए आवश्यक उपकरणों को बनाने का एक शानदार, चरण-दर-चरण तरीका खोज लिया है।