Kinome-wide CRISPR/Cas9-knockout screening reveals critical protein kinases in vasopressin V2-receptor signaling

कल्पना कीजिए कि आपका शरीर एक हलचल भरा शहर है, और किडनी पानी के उपचार संयंत्रों (water treatment plants) की तरह है जो सब कुछ बाढ़ से बचाने या सूखने से रोकने का काम करती है। इस प्लांट का बॉस वासोप्रेसिन (vasopressin) नामक एक हार्मोन है। जब शहर को पानी को रोक कर रखने की आवश्यकता होती है, तो वासोप्रेसिन किडनी की कोशिकाओं को एक संदेश भेजता है: "पानी के चैनलों को चालू करो!" इन चैनलों को AQP2 कहा जाता है, और ये खुले फ्लडगेट्स की तरह काम करते हैं जिससे पानी को पुन: अवशोषित (reabsorbed) किया जा सके।

लेकिन कोशिका को यह कैसे पता चलता है कि स्विच को ठीक उसी तरह कैसे घुमाया जाए? यह केवल एक साधारण ऑन/ऑफ बटन नहीं है; यह एक जटिल कंट्रोल रूम है जो प्रोटीन काइनेज (protein kinases) नामक छोटी मशीनों से भरा है। ये मशीनें फोरमैन (foremen) की तरह हैं जो अन्य प्रोटीनों पर "फॉस्फेट" टैग लगाते हैं ताकि उन्हें बताया जा सके कि क्या करना है।

इस अध्ययन में, NIH के वैज्ञानिकों ने एक विशाल "बॉस कौन है?" का खेल खेलने का निर्णय लिया। उन्होंने एक उच्च-तकनीकी उपकरण जिसे CRISPR (इसे आणविक कैंची की तरह समझें) कहा जाता है, का उपयोग करके किडनी की कोशिकाओं में ज्ञात सभी 714 प्रोटीन काइनेज को एक-एक करके बाहर निकाल दिया। वे यह देखना चाहते थे कि वास्तव में पानी के चैनलों को चालू करने के लिए कौन से फोरमैन आवश्यक हैं।

महान काइनेज खोज (The Great Kinase Hunt)

परिणाम देखने के लिए, वैज्ञानिकों ने एक विशेष "रिपोर्टर" कोशिका बनाई। उन्होंने AQP2 जीन से एक हरी रोशनी (GFP) को जोड़ दिया। इसलिए, जब भी कोशिका सफलतापूर्वक पानी के चैनलों को चालू करती, वह चमकीली हरी हो जाती। यदि कोई विशिष्ट काइनेज गायब था और हरी रोशनी बंद रही, तो वह काइनेज एक "पॉजिटिव रेगुलेटर" था—एक महत्वपूर्ण फोरमैन। यदि हरी रोशनी बहुत अधिक तेज हो गई या जब उसे चालू नहीं होना चाहिए था तब चालू हो गई, तो वह काइनेज एक "नेगेटिव रेगुलेटर" था—एक ब्रेक पेडल।

यहाँ उन्हें क्या मिला:

1. अपेक्षित फोरमैन ("पुराने गार्ड")
जैसा कि वैज्ञानिकों ने अनुमान लगाया था, सबसे महत्वपूर्ण पॉजिटिव रेगुलेटर PKA (विशेष रूप से Prkaca सबयूनिट) था। यह क्लासिक फोरमैन है जो वासोप्रेसिन के शो को चलाता है। जब उन्होंने PKA को बाहर निकाला, तो हरी रोशनी बंद हो गई। उन्होंने पाया कि Prkar1a, जो PKA की एक रेगुलेटरी सबयूनिट है, एक ब्रेक के रूप में कार्य करता है। जब इसे बाहर निकाला गया, तो रोशनी चालू रही। इसने पुष्टि की कि उनकी विधि पूरी तरह से काम कर रही थी।

2. आश्चर्यजनक पॉजिटिव रेगुलेटर: Dyrk1a
स्क्रीन ने एक नया सितारा खोजा: Dyrk1a। जब वैज्ञानिकों ने इस काइनेज को बाहर निकाला, तो कोशिकाएं हरी चमकना बंद कर दीं। लेकिन यहाँ एक मोड़ था: ऐसा इसलिए नहीं था क्योंकि पानी का स्विच टूट गया था।

• उपमा: कल्पना कीजिए कि कोशिका एक कारखाना है। Dyrk1a वह मैनेजर है जो श्रमिकों को शांत और उनके विशिष्ट कार्यों (विभेदन/differentiation) पर केंद्रित रखता है। जब Dyrk1a गायब होता है, तो श्रमिक बेचैन हो जाते हैं, इधर-उधर भागने लगते हैं और खुद को विभाजित करने की कोशिश करते हैं (सेल साइकिल में प्रवेश करते हैं)। क्योंकि कारखाने में अराजकता है, इसलिए पानी के चैनल उत्पादन की लाइन बंद हो जाती है।
• प्रमाण: वैज्ञानिकों ने कोशिकाओं को मापा और पाया कि वे विश्राम अवस्था (G0/G1 चरण) से एक व्यस्त विभाजन अवस्था (S और G2 चरण) में बदल रही थीं। उन्होंने यह भी देखा कि "कोशिका विभाजन" के जीन बढ़ गए, जबकि "विशेष किडनी सेल जॉब्स" के जीन कम हो गए। इसलिए, Dyrk1a आवश्यक है, लेकिन इसलिए नहीं कि यह पानी के स्विच का हिस्सा है; बल्कि इसलिए क्योंकि यह कोशिका को अपना काम करने के लिए सही "मूड" में रखता है।

3. आश्चर्यजनक नेगेटिव रेगुलेटर्स: TGF-β और LKB1
स्क्रीन ने कुछ ऐसे "ब्रेक" भी खोजे जो पानी के चैनलों को बहुत आसानी से चालू होने से रोकते हैं।

• TGF-β रिसेप्टर्स (Tgfbr1, Tgfbr2, Tgfbr3): ये ब्रेक के रूप में कार्य करते हैं। स्क्रीन में, जब वैज्ञानिकों ने इन रिसेप्टर्स को काटा, तो हरी रोशनी वास्तव में अधिक चमकीली हो गई (क्योंकि ब्रेक हटा दिया गया था)। हालाँकि, वैज्ञानिक यह जानना चाहते थे कि जब ये ब्रेक लगाए जाते हैं तो क्या होता है। जब उन्होंने कोशिकाओं को TGF-β (वह संकेत जो इन रिसेप्टर्स को सक्रिय करता है) के संपर्क में रखा, तो पानी के चैनल बंद हो गए। क्यों? क्योंकि TGF-β एक संकेत है जो किडनी की कोशिकाओं को "डी-डिफरेंशिएट" करने या अपना आकार बदलने (एक प्रक्रिया जिसे एपिथेलियल-टू-मेसेनकाइमल ट्रांजिशन कहा जाता है) के लिए कहता है। यह एक निर्माण दल की तरह है जो विशेष पानी के पाइपों को गिराकर कुछ और बनाने के लिए उन्हें तोड़ रहा है। अध्ययन ने दिखाया कि TGF-β एक्सपोजर ने V2 रिसेप्टर (वह एंटीना जो वासोप्रेसिन को सुनता है) और AQP2 चैनलों को कम कर दिया, जिससे प्रभावी रूप से "वासोप्रेसिन एस्केप" (जहाँ शरीर पानी को रोकने के संकेत को सुनना बंद कर देता है) हुआ।
• LKB1 (Stk11): यह सबसे रोमांचक खोज थी। जब उन्होंने LKB1 को बाहर निकाला, तो पानी के चैनल बिना किसी वासोप्रेसिन संकेत के ही चालू हो गए!
  • तंत्र (Mechanism): पेपर सुझाव देता है कि यहाँ एक चतुर खींचतान चल रही है। सामान्यतः, LKB1 SIKs नामक एंजाइमों के एक समूह को सक्रिय करता है। ये SIKs एक सहायक प्रोटीन CRTC के लिए हथकड़ी की तरह काम करते हैं, ताकि वह पानी के स्विच को चालू करने में मदद न कर सके।
  • वासोप्रेसिन की चाल: जब वासोप्रेसिन आता है, तो वह PKA को SIKs को फॉस्फोराइलेट (टैग करने) के लिए कहता है, जिससे SIKs की पकड़ CRTC पर ढीली हो जाती है। CRTC स्वतंत्र होकर स्विच चालू करने में मदद कर सकता है।
  • LKB1 की चाल: यदि आप LKB1 को हटा देते हैं, तो SIKs को शुरू में ही सक्रिय नहीं किया जाता है। हथकड़ी कभी लगाई ही नहीं जाती, इसलिए CRTC हमेशा पानी के चैनलों को चालू करने के लिए स्वतंत्र रहता है।
  • प्रमाण: वैज्ञानिकों ने RNA स्तरों को मापा और पाया कि LKB1 के बिना कोशिकाओं में AQP2 जीन उसी स्तर पर चालू हो गया जैसा कि उन कोशिकाओं में था जिन्हें वासोप्रेसिन से सराबोर किया गया था। उन्होंने प्रोटीन डेटा भी देखा जिससे पता चला कि वासोप्रेसिन सामान्य रूप से SIKs पर फॉस्फोराइलेशन बढ़ाता है और CRTC पर इसे कम करता है, जो मॉडल के साथ पूरी तरह फिट बैठता है।

उन्होंने क्या खारिज किया

पेपर बहुत सावधानी से कहता है कि PKA-Cat-β (मुख्य PKA फोरमैन का जुड़वां भाई) यहाँ मुख्य खिलाड़ी नहीं है। भले ही वे लगभग एक जैसे दिखते हों, लेकिन PKA-Cat-α को काटने से पानी के चैनल रुक गए, जबकि PKA-Cat-β को काटने से ऐसा नहीं हुआ। यह साबित करता है कि इन दोनों जुड़वां भाइयों के कोशिका में अलग-अलग काम हैं, संभवतः इसलिए क्योंकि वे अलग-अलग इलाकों में रहते हैं।

वे कितने आश्वस्त हैं?

वैज्ञानिक अपने द्वारा पाए गए 26 "हिट्स" की सूची के बारे में बहुत आश्वस्त हैं क्योंकि उन्होंने 714 लक्ष्यों की एक विशाल लाइब्रेरी का उपयोग किया और प्रयोग को दो बार दोहराया।

• सत्यापित (Validated): उन्होंने Dyrk1a, Stk11 (LKB1), और TGF-β रिसेप्टर्स को महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में सत्यापित किया क्योंकि उन्होंने इन जीनों के बिना विशिष्ट सेल लाइन्स बनाईं और उच्च-तकनीकी माइक्रोस्कोप और DNA अनुक्रमों (sequencers) के साथ परिणामों को मापा। पेपर नोट करता है कि हालांकि स्क्रीन ने 26 हिट्स की पहचान की, लेकिन उन्होंने अपने विस्तृत सत्यापन अध्ययनों के लिए इस विशिष्ट उपसमूह पर ध्यान केंद्रित किया।
• सुझाया गया (Suggested): LKB1 के विशिष्ट आणविक तंत्र (SIKs और CRTC वाले हथकड़ी मॉडल के रूप में) को एक तर्कसंगत परिकल्पना और एक मॉडल के रूप में प्रस्तुत किया गया है जो मौजूदा प्रोटीन डेटा और उनके नए RNA डेटा द्वारा मजबूती से समर्थित है, लेकिन इसे निश्चित रूप से सिद्ध तथ्य के रूप में दावा नहीं किया गया है।
• मापा गया (Measured): उन्होंने सटीक संख्याएँ मापीं, जैसे कि TGF-β डालने पर AQP2 mRNA में 86% की कमी, और LKB1 को हटाने पर AQP2 mRNA में भारी वृद्धि ( 190 से 5126 ट्रांसक्रिप्ट्स तक)।

निचोड़ (The Bottom Line)

यह अध्ययन एक जासूसी कहानी की तरह है जहाँ पुलिस (वैज्ञानिकों) ने हर संदिग्ध (काइनेज) से पूछताछ की। उन्होंने सामान्य संदिग्धों (PKA) को पाया, लेकिन उन्होंने एक नए मैनेजर (Dyrk1a) को भी खोज निकाला जो शहर को व्यवस्थित रखता है, और एक नए सुरक्षा गार्ड (LKB1) को भी खोज निकाला जो आमतौर पर पानी के गेटों को लॉक करता है लेकिन पानी को बहने देने के लिए उसे बायपास किया जा सकता है।

जबकि पेपर सुझाव देता है कि ये निष्कर्ष भविष्य में पानी के संतुलन संबंधी विकारों (जैसे नेफ्रोजेनिकिक डायबिटीज इनसिपिडस) का इलाज करने में मदद कर सकते हैं, लेखक सावधानी बरतते हुए कहते हैं कि यह तो बस शुरुआत है। उन्होंने खिलाड़ियों और खेल के नियमों की पहचान कर ली है, लेकिन चिकित्सा के लिए इसका उपयोग करने की पूर्ण रणनीति अभी लिखी जा रही है।