A membrane-impermeant nucleic acid dye converts bacteriophage plaque assays into a machine-readable format for automated counting
यह अध्ययन यह प्रदर्शित करता है कि बैक्टीरियोफेज प्लेक (bacteriophage plaques) को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए एक मेम्ब्रेन-इम्पर्मिएंट (membrane-impermeant) न्यूक्लिक एसिड डाई का उपयोग करना उच्च-कंट्रास्ट वाली छवियां बनाता है जो सरल, ओपन-सोर्स स्वचालित गणना पाइपलाइनों के अनुकूल हैं, जिससे बिना किसी जेनेटिक इंजीनियरिंग या जटिल मशीन लर्निंग की आवश्यकता के विविध फेज-होस्ट प्रणालियों में उच्च-थ्रूपुट और सांख्यिकीय रूप से कठोर मात्रात्मक निर्धारण सक्षम होता है।
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वायरस की सूक्ष्म दुनिया की कल्पना एक विशाल, जेली जैसे मंच पर खेले जाने वाले लुका-छिपी के उच्च-दांव वाले खेल के रूप में करें। इस खेल में, खिलाड़ी बैक्टीरियोफेज (या संक्षेप में "फेज") हैं, जो बैक्टीरिया का शिकार करने वाले नन्हे वायरस हैं। यह देखने के लिए कि कौन जीतता है, वैज्ञानिक एक क्लासिक ट्रिक का उपयोग करते हैं जिसे "प्लाक असायी" (plaque assay) कहा जाता है। वे फेजों को बैक्टीरिया के झुंड के साथ एक नरम, जिलेटिनस परत में मिलाते हैं। जहाँ भी एक फेज को बैक्टीरिया मिलता है और वह उसे फाड़कर नष्ट कर देता है, वह पीछे एक छोटा, अदृश्य गड्ढा छोड़ देता है। समय के साथ, ये गड्ढे स्पष्ट, गोल धब्बों में बदल जाते हैं जिन्हें "प्लाक" कहा जाता है, जो एक तारों भरी रात में छोटे चंद्रमाओं की तरह दिखते हैं। इन चंद्रमाओं को गिनना वैज्ञानिकों को यह बताता है कि एक नमूने में कितने फेज वायरस मौजूद हैं।
हालाँकि, इसमें एक पेंच है: ये "चंद्रमा" अक्सर धुंधले, अस्पष्ट होते हैं या पृष्ठभूमि में मिल जाते हैं, जिससे उन्हें आँखों से गिनना अविश्वसनीय रूप से कठिन हो जाता है। यह बादलों वाले दिन बर्फ के फाहे (snowflakes) गिनने की कोशिश करने जैसा है। दशकों से, वैज्ञानिकों को घंटों तक पेट्री डिशों को घूरना पड़ा है, और हर एक धब्बे की मैन्युअल रूप से गिनती करनी पड़ी है। यह धीमा, उबाऊ और मानवीय त्रुटियों के प्रति संवेदनशील है, खासकर जब आपको एक साथ सैकड़ों प्रयोग चलाने हों। बड़ा सवाल यह रहा है: हम इन अदृश्य धब्बों को इतना चमकदार कैसे बना सकते हैं कि कंप्यूटर उन्हें तुरंत गिन सके, बिना वायरसों को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किए या कोई बहुत महंगा रोबोट बनाए?
यह शोध पत्र एक चतुर, लो-टेक समाधान पेश करता है जो इन अदृश्य गड्ढों को चमकते हुए संकेतों में बदल देता है। शोधकर्ताओं ने SYTOX नामक एक विशेष डाई का उपयोग किया, जो एक "चमकने वाले पेंट" की तरह काम करती है जो केवल मृत चीजों से चिपकती है। सामान्यतः, यह डाई स्वस्थ, जीवित बैक्टीरिया के अंदर नहीं जा सकती क्योंकि उनकी कोशिका भित्तियाँ (cell walls) मजबूत, सीलबंद दरवाजों की तरह होती हैं। लेकिन जब एक फेज बैक्टीरिया पर हमला करता है और उसे फाड़ देता है, तो वह उस दरवाजे को तोड़ देता है। डाई अंदर दौड़ पड़ती है, उजागर हुए DNA को गले लगा लेती है, और अचानक, वह मृत स्थान एक शानदार फ्लोरोसेंट चमक के साथ जगमगा उठता है।
टीम ने इस "ग्लो-अप" विधि का विभिन्न प्रकार के फेज वायरसों पर परीक्षण किया, जिनमें से कुछ गोल हैं, कुछ लंबे कीड़ों जैसे दिखते हैं, और कुछ एक बुलबुले जैसी लिफाफे में लिपटे हुए हैं। उन्होंने पाया कि अधिकांश वायरसों के लिए, प्रयोग शुरू करने से पहले जेल में डाई मिलाने से प्लाक हाई-डेफिनिशन फ्लोरोसेंस में उभर आते हैं। जब उन्होंने इन चमकते हुए प्लेटों की तस्वीरें लीं और उन्हें एक मुफ्त, ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर (एक प्रोग्राम जिसे ImageJ कहा जाता है) के माध्यम से चलाया, तो कंप्यूटर लगभग पूरी तरह से धब्बों को गिन सका, जो मानव विशेषज्ञों की गिनती से मेल खाता था। ऐसा लग रहा था जैसे कंप्यूटर को अचानक सुपर-विज़न मिल गया हो, जहाँ मानव आँख संघर्ष करती थी वहाँ वह प्लाक को स्पष्ट रूप से देख पा रहा था।
हालाँकि, यह विधि हर एक परिदृश्य के लिए एकदम सटीक नहीं थी। शोधकर्ताओं ने पाया कि एक विशिष्ट प्रकार के फेज (M13) के लिए, जो अपने होस्ट को तुरंत नहीं मारता बल्कि धीरे-धीरे नए वायरस बाहर निकालता है, चमक अगले दिन दिखाई दी। यह जैविक रूप से तर्कसंगत है, क्योंकि कोशिकाएं अधिक समय तक जीवित रहती हैं, जिससे डाई तब तक बाहर रहती है जब तक कि वे अंततः हार नहीं मान देतीं। उन्होंने यह भी पाया कि एक कठिन, ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया सिस्टम के लिए, प्रयोग से पहले डाई मिलाने से प्लाक बनना ही रुक गया। लेकिन, उनके पास एक बैकअप प्लान था: उन्होंने पहले प्लाक बनने का इंतजार किया, और फिर डाई डाली। यह "पोस्ट-पार्टी" दृष्टिकोण भी उतना ही प्रभावी रहा, जो साबित करता है कि यह विधि लचीली है।
शायद सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि वैज्ञानिकों ने यह जांचा कि क्या यह चमकने वाली डाई वायरसों को भविष्य के उपयोग के लिए खराब कर देगी। उन्होंने जेल से कुछ चमकते हुए धब्बों को निकाला और उन्हें फिर से उगाने की कोशिश की। अधिकांश वायरसों के लिए, डाई ने उन्हें बिल्कुल नुकसान नहीं पहुँचाया। एक वायरस (MS2) के लिए, डाई ने जीवित बचे लोगों की संख्या को थोड़ा कम कर दिया, लेकिन यह कोई बड़ी समस्या नहीं थी। यह सुझाव देता है कि वैज्ञानिक अपने वायरसों को तेजी से और सटीक रूप से गिनने के लिए इस चमकने वाली डाई का उपयोग कर सकते हैं, और फिर उन्हीं वायरसों का आगे के प्रयोगों के लिए उपयोग भी कर सकते हैं।
संक्षेप में, यह शोध पत्र दिखाता है कि वायरस गिनने को स्वचालित करने के लिए आपको फैंसी रोबोट या जेनेटिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता नहीं है। आपको बस थोड़ी सी चमकने वाली डाई और एक मुफ्त कंप्यूटर प्रोग्राम की आवश्यकता है। इन धुंधले, कठिन-से-दिखने वाले धब्बों को चमकीले, मशीन-पठनीय संकेतों में बदलकर, यह सरल ट्रिक वैज्ञानिकों को बड़े, अधिक सटीक प्रयोग तेजी से चलाने में मदद कर सकती है, जिससे वायरल गड्ढों को गिनने के उबाऊ काम को एक त्वरित, स्वचालित कार्य में बदला जा सकता है।
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