An intersectional expression platform for gene complementation using RNA-fragment end joining (REJ)
यह शोध पत्र एक इंजीनियर आरएनए-फ्रैगमेंट एंड जॉइनिंग (REJ) प्लेटफॉर्म प्रस्तुत करता है जो अलग-अलग आरएनए इकाइयों को कार्यात्मक एमआरएनए (mRNAs) में कुशलतापूर्वक स्प्लिस करने के लिए संरचित मॉड्यूलर आरएनए खंडों का उपयोग करता है, जिससे व्यापक स्क्रीनिंग की आवश्यकता के बिना मजबूत जीन कॉम्प्लीमेंटेशन, इंटरसेक्शनल सेल लेबलिंग और बड़े प्रोटीन की अभिव्यक्ति सक्षम होती है।
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प्रत्येक जीवित वस्तु की कोशिकाओं के भीतर, एक जटिल असेंबली लाइन लगातार काम करती है ताकि उन प्रोटीनों का निर्माण किया जा सके जो जीवन को चलाए रखते हैं। यह प्रक्रिया डीएनए (DNA) में लिखे गए निर्देशों के एक सेट के साथ शुरू होती है, जिन्हें एक अस्थायी संदेश जिसे आरएनए (RNA) कहा जाता है, में कॉपी किया जाता है। इस संदेश का उपयोग प्रोटीन बनाने के लिए करने से पहले, इसे संपादित (edit) किया जाना चाहिए। कोशिकाओं के पास एक प्राकृतिक मशीनरी होती है जो कैंची और ग्लू गन (glue gun) की तरह काम करती है, जो अनावश्यक हिस्सों को काट देती है और शेष टुकड़ों को एक एकल, निरंतर स्ट्रैंड में सिल देती है। यह संपादन चरण इतना विश्वसनीय है कि वैज्ञानिक लंबे समय से जीन कैसे काम करते हैं, इसे समझने के लिए इस पर भरोसा करते आए हैं। हालाँकि, यह मशीनरी आमतौर पर केवल आरएनए के एक एकल, निरंतर स्ट्रैंड पर ही काम करती है। यह सामान्य रूप से आरएनए के दो अलग-अलग, तैरते हुए टुकड़ों को जोड़ने से इनकार करती है जो संयोग से एक-दूसरे के पास तैर रहे हों, जो एक सुरक्षा कवच है ताकि कोशिका गलती से स्कैम्बल (scrambled) या निरर्थक निर्देश न बना ले।
शोधकर्ताओं के लिए, अलग-अलग स्ट्रैंड्स को जोड़ने से इनकार करने का यह प्राकृतिक स्वभाव एक महत्वपूर्ण बाधा प्रस्तुत करता है। कई जीन इतने बड़े होते हैं कि वे उन छोटे डिलीवरी वाहनों, जिन्हें वायरल वेक्टर (viral vectors) कहा जाता है, में फिट नहीं हो पाते जिनका उपयोग वैज्ञानिक शरीर में नया आनुवंशिक पदार्थ पेश करने के लिए करते हैं। जब कोई जीन बहुत बड़ा होता है, तो उसे छोटे टुकड़ों में विभाजित करना पड़ता है और अलग-अलग पहुँचाना पड़ता है, लेकिन कोशिका की प्राकृतिक मशीनरी उन्हें सही ढंग से फिर से जोड़ने में विफल रहती है। इस सीमा ने वैज्ञानिकों को जटिल समाधान विकसित करने के लिए मजबूर किया है जिनमें विदेशी प्रोटीन या रासायनिक प्रतिक्रियाएं शामिल हैं, जो कभी-कभी अवांछित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं (immune responses) पैदा कर सकती हैं या पीछे "जेनेटिक निशान" (genetic scars) छोड़ सकती हैं। सवाल यह था कि क्या कोशिका के अपने प्राकृतिक संपादन उपकरणों को अलग-अलग आरएनए टुकड़ों को कुशलतापूर्वक और सफाई से जोड़ने के लिए किसी विदेशी एजेंट की आवश्यकता के बिना धोखा दिया जा सकता है।
साल्क इंस्टीट्यूट (Salk Institute) के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब एक ऐसा सिस्टम विकसित किया है जो बिल्कुल यही करता है। उन्होंने एक विधि विकसित की है जिसे वे आरएनए एंड-जॉइनिंग (RNA end-joining) या REJ कहते हैं, जो कोशिका को दो अलग-अलग आरएनए स्ट्रैंड्स को एक एकल, कार्यात्मक संदेश में सिलने की अनुमति देता है। उनकी सफलता की कुंजी लगभग 250 अक्षरों के जेनेटिक कोड का एक छोटा, सिंथेटिक मॉड्यूल (synthetic module) था। ये मॉड्यूल एक पुल (bridge) के रूप में कार्य करते हैं। जब इन्हें दो अलग-अलग आरएनए स्ट्रैंड्स के सिरों से जोड़ा जाता है, तो ये विशिष्ट आकार में मुड़ जाते हैं जो एक-दूसरे को पकड़ लेते हैं, जिससे दोनों स्ट्रैंड्स एक-दूसरे के करीब आ जाते हैं। एक बार जब स्ट्रैंड्स को एक जगह थाम लिया जाता है, तो कोशिका की अपनी प्राकृतिक स्प्लिसिंग (splicing) मशीनरी जुड़ाव को पहचान लेती है और स्टिचिंग (stitching) का कार्य करती है, जिससे दो टुकड़े मिलकर एक पूर्ण, निरंतर आरएनए अणु बन जाते हैं।
शोधकर्ताओं ने एक चमकते पीले प्रोटीन को बनाने वाले जीन को दो अलग-अलग, गैर-कार्यात्मक हिस्सों में विभाजित करके इस प्रणाली का परीक्षण किया। जब उन्होंने इन दो हिस्सों को इन विशेष ब्रिजिंग मॉड्यूल्स के साथ कोशिकाओं में पहुँचाया, तो कोशिकाओं ने सफलतापूर्वक निर्देशों को पुनर्गठित किया और चमकना शुरू कर दिया। टीम ने पाया कि यह विधि उल्लेखनीय सटीकता के साथ काम करती है। परिणामी प्रोटीन उस एकल, अविभाजित जीन द्वारा उत्पादित प्रोटीन के समान था, जिसमें जोड़ने की प्रक्रिया से कोई अतिरिक्त या छूटा हुआ हिस्सा नहीं बचा था। यह "स्कार-फ्री" (scar-free) परिणाम अन्य तरीकों की तुलना में एक बड़ा लाभ है, जो अक्सर जोड़ने की प्रक्रिया के बाद छोटे, संभावित रूप से विघटनकारी अवशेष छोड़ देते हैं। इसके अलावा, क्योंकि यह प्रणाली पूरी तरह से कोशिका के अपने आंतरिक उपकरणों पर निर्भर करती है, इसलिए इसमें प्रतिरक्षा प्रणाली को सतर्क करने वाले विदेशी प्रोटीन पेश करने की आवश्यकता नहीं होती है।
सिस्टम को सुरक्षित और विश्वसनीय बनाने के लिए, वैज्ञानिकों ने इसका कठोर परीक्षण किया। उन्होंने जांच की कि क्या ब्रिजिंग मॉड्यूल्स गलती से कोशिका के भीतर गलत आरएनए स्ट्रैंड्स को पकड़ सकते हैं, जिससे कोशिका हानिकारक, स्कैम्बल प्रोटीन बना सकती है। अत्यधिक मात्रा में आरएनए के साथ चरम स्थितियों में भी जब उन्होंने इस प्रणाली को काम करने के लिए मजबूर किया, तब भी ब्रिजिंग मॉड्यूल्स अत्यधिक चयनात्मक रहे, और लगभग विशेष रूप से अपने सही साथियों को ही जोड़ते रहे। शोधकर्ताओं ने यह भी देखा कि क्या यह प्रणाली कोशिका की प्रतिरक्षा रक्षा प्रणाली को कोई अलार्म ट्रिगर करती है। उन्होंने पाया कि ऐसी कोई प्रतिक्रिया नहीं हुई; कोशिकाएं सामान्य रूप से विकसित हुईं और कार्य करती रहीं, और उनकी आंतरिक जेनेटिक प्रोफाइल उन कोशिकाओं की तुलना में अपरिवर्तित रही जिन्हें उपचार नहीं मिला था।
इस नए प्लेटफॉर्म की बहुमुखी प्रतिभा शायद इसकी सबसे उल्लेखनीय विशेषता है। शोधकर्ताओं ने प्रदर्शन किया कि वे इसका उपयोग दृष्टि और मांसपेशियों के कार्य के लिए महत्वपूर्ण कई बड़े जीनों को पुनर्गठित करने के लिए कर सकते हैं, जो अक्सर मानक वितरण विधियों के लिए बहुत बड़े होते हैं। उन्होंने स्टारगार्ट रोग (Stargardt disease) नामक अंधापन के एक रूप में शामिल एक विशाल प्रोटीन को सफलतापूर्वक बनाया, जिससे पूर्ण प्रोटीन का स्तर उन उन्नत विधियों के समान प्राप्त हुआ जो अन्य तरीकों से प्राप्त किया जाता है, लेकिन बहुत कम अवांछित अंशों के साथ। यह प्रणाली तीन अलग-अलग आरएनए टुकड़ों को सही क्रम में जोड़ने में भी सक्षम सिद्ध हुई, जिससे और भी अधिक जटिल जेनेटिक इंजीनियरिंग का मार्ग प्रशस्त हुआ।
केवल टूटे हुए जीनों को ठीक करने से परे, यह तकनीक यह नियंत्रित करने का एक शक्तिशाली नया तरीका प्रदान करती है कि एक जीन कब और कहाँ सक्रिय होगा। चूंकि एक जीन के दो हिस्से तभी पुनर्गठित होंगे जब वे एक ही कोशिका में मौजूद हों, इसलिए वैज्ञानिक इस प्रणाली का उपयोग विशिष्ट "जेनेटिक लॉजिक सर्किट" (genetic logic circuits) बनाने के लिए कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक जीन को इस तरह डिज़ाइन किया जा सकता है कि वह तभी कार्य करे जब दो अलग-अलग जैविक संकेत एक ही समय में मौजूद हों, जिससे शोधकर्ता एक जटिल ऊतक के भीतर बहुत विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित कर सकें। टीम ने अन्य वैज्ञानिकों को ऐसे कस्टम जेनेटिक सर्किट डिजाइन करने में मदद करने के लिए एक डिजिटल टूल भी बनाया, जिससे यह तकनीक भविष्य के अध्ययन के लिए व्यापक रूप से सुलभ हो गई।
यह कार्य सटीक और सुरक्षित तरीके से जेनेटिक जानकारी को हेरफेर करने की क्षमता में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। कोशिका की अपनी प्राकृतिक मशीनरी का उपयोग करके और सरल, सिंथेटिक आरएनए ब्रिज के माध्यम से मार्गदर्शन करके, शोधकर्ताओं ने एक ऐसी विधि बनाई है जो कुशल और व्यापक रूप से लागू करने योग्य है। यह उन बड़े, चिकित्सीय जीनों को वितरित करने का एक तरीका प्रदान करता है जिन्हें पहले ले जाना असंभव था, और यह समझने के लिए एक नया टूलकिट प्रदान करता है कि जीवित कोशिकाओं के जटिल परिदृश्य के भीतर जीन कैसे परस्पर क्रिया करते हैं। निष्कर्ष बताते हैं कि यह दृष्टिकोण जीन थेरेपी और जैविक अनुसंधान के लिए एक मानक पद्धति बन सकता है, जो मानव शरीर में जेनेटिक निर्देशों को मरम्मत करने या बदलने का एक स्वच्छ, विश्वसनीय और सुरक्षित तरीका प्रदान करता है।
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