Identification of active deubiquitinases in dendritic cells under unstimulated and activated conditions.
यह अध्ययन अनउत्तेजित और CpG-उत्तेजित दोनों स्थितियों में डेंड्रिटिक कोशिकाओं में डीयूबिक्विटिनेसेस (deubiquitinases) की गतिविधि और प्रचुरता को व्यवस्थित रूप से प्रोफाइल करने के लिए गतिविधि-आधारित प्रोब्स और प्रोटिओमिक्स का उपयोग करता है, जो गतिशील परिवर्तनों को प्रकट करता है जो आगे के अन्वेषण के लिए प्रमुख एंजाइमों की पहचान करता है।
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प्रतिरक्षा प्रणाली खतरों का पता लगाने और रक्षा समन्वय करने के लिए कोशिकाओं के एक परिष्कृत नेटवर्क पर निर्भर करती है। इनमें से, डेंड्रिटिक कोशिकाएं महत्वपूर्ण प्रहरी के रूप में कार्य करती हैं। वे शरीर में गश्त करती हैं, बैक्टीरिया या वायरस जैसे हमलावरों के अंशों को पकड़ती हैं, इस जानकारी को संसाधित करती हैं, और फिर लक्षित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए टी सेल्स (T cells) के सामने इसे प्रस्तुत करती हैं। इन कोशिकाओं के सही ढंग से कार्य करने के लिए, उन्हें विश्राम अवस्था (resting state) और सक्रिय, सतर्क अवस्था के बीच तेजी से स्विच करने में सक्षम होना चाहिए। यह स्विचिंग आणविक टैग (molecular tags) की एक जटिल प्रणाली द्वारा नियंत्रित होती है। सबसे महत्वपूर्ण टैगों में से एक एक छोटा प्रोटीन है जिसे यूबिक्विटिन (ubiquitin) कहा जाता है। जब अन्य प्रोटीनों से जुड़ा होता है, तो यूबिक्विटिन उनके व्यवहार, स्थान या जीवनकाल को बदल सकता है, जो प्रभावी रूप से एक स्विच के रूप में कार्य करता है जो कोशिकीय प्रक्रियाओं को चालू या बंद कर देता है। हालांकि, इस प्रणाली को लचीला बनाए रखने के लिए, इन टैगों को हटाया भी जाना चाहिए। डीयूबिक्विटिनेसेस (deubiquitinases) नामक विशिष्ट एंजाइम यह कार्य करते हैं, जो आणविक इरेज़र (मिटाने वाले) के रूप में कार्य करते हैं जो अपने लक्ष्यों से यूबिक्विटिन टैग को काट देते हैं। इन इरेज़रों के बिना, प्रतिरक्षा प्रणाली अपनी प्रतिक्रियाओं को सूक्ष्म रूप से नियंत्रित करने की क्षमता खो देगी, जिससे संभावित रूप से पुरानी सूजन (chronic inflammation) या संक्रमण से लड़ने में विफलता हो सकती है।
वैज्ञानिक लंबे समय से जानते हैं कि डीयूबिक्विटिनेसेस अत्यंत महत्वपूर्ण हैं, लेकिन उनके पास इस बात का स्पष्ट मानचित्र नहीं था कि डेंड्रिटिक कोशिकाओं के भीतर कौन से विशिष्ट एंजाइम सक्रिय हैं और हमले के दौरान उनका व्यवहार कैसे बदलता है। इस अंतर को भरने के लिए, मेलबर्न विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं ने एक ऐसी तकनीक का सहारा लिया जो न केवल यह देखने की अनुमति देती है कि कौन से एंजाइम मौजूद हैं, बल्कि यह भी कि कौन से वास्तव में काम कर रहे हैं। उन्होंने डेंड्रिटिक कोशिकाओं की एक लाइन का अध्ययन किया, जिसमें से कुछ को विश्राम अवस्था में रखा गया और अन्य को सीपीजी (CpG) नामक एक अणु के साथ उत्तेजित किया गया, जो बैक्टीरिया के डीएनए की उपस्थिति की नकल करता है। सक्रिय एंजाइमों से बंधने के लिए डिज़ाइन किए गए रासायनिक प्रोब (chemical probes) का उपयोग करके, वे कोशिकीय मशीनरी का एक स्नैपशॉट लेने में सक्षम हुए। इस दृष्टिकोण ने खुलासा किया कि इन आणविक इरेज़रों की गतिविधि हमेशा उनकी प्रचुरता (abundance) से मेल नहीं खाती है। दूसरे शब्दों में, किसी एंजाइम की अधिक संख्या होने का मतलब यह नहीं है कि वह अधिक मेहनत कर रहा है, और कुछ एंजाइम जो कम संख्या में मौजूद हैं, वे अत्यधिक सक्रिय हो सकते हैं।
अध्ययन ने पूर्ण चित्र प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग रासायनिक उपकरणों का उपयोग किया। पहला उपकरण, जो एक यूबिक्विटिन अणु के इर्द-गिर्द बनाया गया था, केवल तभी कोशिकाओं में प्रवेश कर सकता था जब उन्हें पहले तोड़ दिया जाए। इस पद्धति ने दिखाया कि जब कोशिकाओं को बैक्टीरियल मिमिक (बैक्टेरियल नकल) द्वारा उत्तेजित किया गया, तो कई विशिष्ट डीयूबिक्विटिनेसेस की गतिविधि बदल गई। उदाहरण के लिए, CYLD नामक एंजाइम की गतिविधि काफी घट गई, जबकि USP16 नामक दूसरे की गतिविधि बढ़ गई। दिलचस्प बात यह है कि इन एंजाइमों की मात्रा हमेशा उसी तरह नहीं बदली जैसे कि वे बदल रहे थे। कुछ एंजाइम अधिक संख्यावान हुए बिना अधिक सक्रिय हो गए, जिससे पता चलता है कि कोशिका मौजूदा एंजाइमों के और अधिक बनने की प्रतीक्षा करने के बजाय, उनके कार्य करने के तरीके को तेजी से समायोजित कर रही थी। शोधकर्ताओं ने पाया कि कुछ एंजाइम, जैसे कि USP18 और OTULIN, उत्तेजना के बाद बहुत अधिक प्रचुर मात्रा में हो गए लेकिन इस पहले प्रोब द्वारा नहीं पहचाने गए। यह इंगित करता है कि प्रोब कुछ प्रकार के एंजाइमों को मिस कर रहा था, संभवतः इसलिए क्योंकि इसे केवल विशिष्ट यूबिक्विटिन टैग को पहचानने के लिए डिज़ाइन किया गया था।
उन एंजाइमों को पकड़ने के लिए जिन्हें पहला उपकरण मिस कर गया था, टीम ने IMP-2373 नामक एक दूसरा, अधिक उन्नत प्रोब इस्तेमाल किया। यह अणु इतना छोटा है कि बिना कोशिकाओं को तोड़े जीवित कोशिकाओं में प्रवेश कर सकता है, जिससे शोधकर्ता सक्रिय एंजाइमों को उनके प्राकृतिक वातावरण में लेबल कर सके। इस पद्धति ने सक्रिय एंजाइमों के एक अलग सेट का खुलासा किया, जिसमें COPS5 और ATXN3 शामिल थे, जो पहले प्रोब में नहीं देखे गए थे। दूसरे उपकरण के उपयोग ने पुष्टि की कि उत्तेजना के प्रति कोशिका की प्रतिक्रिया में एंजाइम गतिविधि का एक जटिल पुनर्गठन शामिल है जिसे केवल प्रोटीन की मात्रा गिनकर नहीं देखा जा सकता है। शोधकर्ताओं ने यह भी सत्यापित किया कि रासायनिक प्रोब ने कोशिकाओं को नुकसान नहीं पहुँचाया या उनके व्यवहार को नहीं बदला, जिससे यह सुनिश्चित हुआ कि उनके द्वारा देखे गए परिवर्तन बैक्टीरियल मिमिक के प्रति एक वास्तविक प्रतिक्रिया थे न कि प्रयोग का कोई कृत्रिम परिणाम (artifact)।
निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया एंजाइम गतिविधि के एक गतिशील संतुलन द्वारा शासित होती है जो सरल प्रोटीन उत्पादन से अलग है। अध्ययन ने डीयूबिक्विटिनेसेस के एक विशिष्ट समूह की पहचान की जो विश्राम अवस्था वाली डेंड्रिटिक कोशिकाओं में सक्रिय हैं, जिनमें से कई कोशिका चक्र और डीएनए मरम्मत को विनियमित करने में शामिल हैं। जब कोशिकाओं को सक्रिय किया गया, तो इन एंजाइमों की गतिविधि बदल गई, जिनमें से कुछ बढ़ीं और कुछ घटीं। यह सुझाव देता है कि कोशिका इस आधार पर अलग-अलग कार्यों को प्राथमिकता देती है कि वह विश्राम पर है या संक्रमण से लड़ रही है। शोध ने TNFAIP3 जैसे प्रसिद्ध एंजाइमों की भूमिका को भी स्पष्ट किया, जो उत्तेजना के बाद अधिक प्रचुर और अधिक सक्रिय दोनों हो गए, जो अति-प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रतिरक्षा संकेतों को कम करने में इसकी ज्ञात भूमिका को पुख्ता करता है। इसके विपरीत, CYLD की गतिविधि गिर गई, जो सक्रियण पर डेंड्रिटिक कोशिकाओं द्वारा अपने सिग्नलिंग पथों को संशोधित करने के बारे में पिछले ज्ञान के अनुरूप है।
इन दोनों विधियों को मिलाकर, शोधकर्ताओं ने तेरह डीयूबिक्विटिनेसेस की पहचान की जिन्होंने कोशिकाओं को उत्तेजित करने पर गतिविधि में स्पष्ट परिवर्तन दिखाया। यह सूची एक नया आधार प्रदान करती है कि डेंड्रिटिक कोशिकाएं अपनी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कैसे नियंत्रित करती हैं। अध्ययन दर्शाता है कि एंजाइम गतिविधि को देखना उतना ही महत्वपूर्ण है जितना कि प्रोटीन स्तर को देखना, क्योंकि दोनों हमेशा एक साथ नहीं चलते हैं। यह कार्य यह भी बताता है कि पूर्ण चित्र देखने के लिए विभिन्न रासायनिक उपकरणों की आवश्यकता होती है, क्योंकि प्रत्येक प्रोब की अपनी ताकत और सीमाएं हैं। हालांकि अध्ययन एक विशिष्ट सेल लाइन में किया गया था, परिणाम डेंड्रिटिक कोशिकाओं में काम करने वाली आणविक मशीनरी का एक विस्तृत ब्लूप्रिंट प्रदान करते हैं। यह ज्ञान भविष्य के अन्वेषणों के लिए द्वार खोलता है कि कैसे इन एंजाइमों को प्रतिरक्षा विकारों के इलाज के लिए लक्षित किया जा सकता है, हालांकि स्वयं पेपर उपचार प्रस्तावित करने के बजाय मानचित्रण (mapping) पर केंद्रित है। प्राथमिक उपलब्धि उन डीयूबिक्विटिनेसेस का एक स्पष्ट, गतिविधि-आधारित प्रोफाइल बनाना है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संचालित करते हैं, जो भागों की एक साधारण सूची से आगे बढ़कर चलती हुई मशीन की कार्यात्मक समझ की ओर ले जाता है।
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