Three-dimensional object-based quantification of nicotinic acetylcholine receptor subunit colocalization using Imaris
यह शोध पत्र इमारीस (Imaris) और एयरिसकैन (Airyscan) सुपर-रिजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए एक पुनरुत्पादनीय, त्रि-आयामी ऑब्जेक्ट-आधारित वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है, जो विरल, बिंदुवत संकेतों (punctate signals) के लिए पारंपरिक तीव्रता-आधारित मेट्रिक्स की सीमाओं को पार करते हुए विशिष्ट तंत्रिका विभाजनों (neural compartments) के भीतर निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर सबयूनिट्स के स्थानिक सह-स्थानीयकरण (spatial colocalization) को परिमाणित करता है।
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मस्तिष्क एक एकल, एकसमान ऊतक का द्रव्यमान नहीं है, बल्कि विशिष्ट कोशिकाओं का एक विशाल नेटवर्क है जो सटीक रासायनिक संकेतों के माध्यम से संचार करती हैं। इन संकेतों के काम करने के लिए, प्राप्त करने वाली कोशिकाओं के पास बिल्कुल सही स्थान पर सही आणविक मशीनरी होनी चाहिए। एक न्यूरॉन को कई कमरों वाले घर के रूप में सोचें; संवाद होने के लिए, प्राप्तकर्ता को उस विशिष्ट कमरे में खड़ा होना चाहिए जहाँ संदेश पहुँचाया जा रहा है, न कि केवल इमारत में कहीं भी। वैज्ञानिक लंबे समय से जानते हैं कि न्यूरॉन्स के बीच के संबंध महत्वपूर्ण हैं, लेकिन वे अब जाकर उन कनेक्शनों के भीतर मौजूद आणविक फर्नीचर का मानचित्र बनाना शुरू कर रहे हैं। विशेष रूप से, वे इस बात को समझने की कोशिश कर रहे हैं कि विभिन्न प्रकार के रासायनिक रिसेप्टर्स—वे सूक्ष्म प्रोटीन जो संकेतों को पकड़ते हैं—तंत्रिका कोशिकाओं की सतह पर कैसे व्यवस्थित हैं। यदि ये रिसेप्टर्स आपस में मिले हुए हैं या अलग रखे गए हैं, तो यह न्यूरॉन के दुनिया के प्रति व्यवहार को बदल देता है।
तंत्रिका तंत्र के अध्ययन के लिए एक सामान्य मॉडल, फल मक्खी (फ्रूट फ्लाई) में, शोधकर्ताओं ने पाया है कि तेज़ उत्तेजक संकेतों (excitatory signals) के लिए जिम्मेदार रासायनिक रिसेप्टर्स अविश्वसनीय रूप से विविध हैं। ये रिसेप्टर्स विभिन्न हिस्सों से बने होते हैं, जैसे कि विभिन्न टुकड़ों से बनी एक पहेली, और इन टुकड़ों का संयोजन यह निर्धारित करता है कि रिसेप्टर कैसे कार्य करता है। एक हालिया अध्ययन ने लार्वा फल मक्खी के मोटर न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया, जो गति को नियंत्रित करते हैं। शोधकर्ता यह जानना चाहते थे कि क्या इन रिसेप्टर के विभिन्न प्रकार के हिस्से न्यूरॉन की सतह पर एक ही छोटे स्थानों में रह रहे हैं या वे एक-दूसरे से अलग रह रहे हैं। इसका उत्तर देने के लिए, उन्हें इन सूक्ष्म, बिखरे हुए धब्बों को तीन आयामों (3D) में देखने और उन्हें अत्यधिक सटीकता के साथ गिनने के तरीके की आवश्यकता थी, जो एक ऐसा कार्य था जिसे मानक सूक्ष्मदर्शी और सरल गिनती विधियाँ नहीं संभाल सकती थीं।
टीम ने एक शक्तिशाली सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके इन रिसेप्टर्स को देखने का एक नया तरीका विकसित किया जो एक मानक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी (light microscope) की तुलना में बहुत अधिक सूक्ष्म विवरण देख सकता है। उन्होंने उन फल मक्खी लार्वा का उपयोग किया जिन्हें आनुवंशिक रूप से इस तरह संशोधित किया गया था कि उनके प्राकृतिक रिसेप्टर्स को सूक्ष्म फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ टैग किया गया था, जिससे वे सूक्ष्मदर्शी के नीचे चमकने लगे। केवल छवि की समग्र चमक को देखने के बजाय, जो कि बिखरे हुए संकेतों के मामले में भ्रामक हो सकती है, शोधकर्ताओं ने प्रत्येक चमकते धब्बे को एक अलग, तीन-आयामी वस्तु के रूप में माना। उन्होंने हर एक रिसेप्टर क्लस्टर के आकार को ट्रेस करने के लिए विशेष सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया, जिससे प्रत्येक एक के स्थान का एक डिजिटल मानचित्र तैयार हुआ। इस दृष्टिकोण ने उन्हें यह अनुमान लगाने से आगे बढ़ने की अनुमति दी कि क्या दो संकेत पास हैं, और इसके बजाय उनके बीच वास्तविक भौतिक ओवरलैप (overlap) को मापने में सक्षम बनाया।
अपने मापन को सटीक बनाने के लिए, वैज्ञानिकों ने पहले अपने तरीके का परीक्षण दो ज्ञात स्थितियों पर किया। एक मामले में, उन्होंने बिल्कुल एक ही रिसेप्टर से जुड़े दो अलग-अलग टैगों को देखा; स्वाभाविक रूप से, वे लगभग पूरी तरह से ओवरलैप होने चाहिए। दूसरे मामले में, उन्होंने दो ऐसे रिसेप्टर्स को देखा जो ज्ञात रूप से अलग स्थानों पर होते हैं; उन्हें लगभग कोई ओवरलैप नहीं दिखाना चाहिए। इन ज्ञात उदाहरणों की तुलना करके, उन्होंने एक स्पष्ट नियम स्थापित किया कि क्या "ओवरलैप" माना जाए। उन्होंने पाया कि यदि दो रिसेप्टर क्लस्टर्स एक ही स्थान साझा करते हैं, विशेष रूप से कम से कम 0.05 क्यूबिक माइक्रोमीटर का ओवरलैप, तो उन्हें एक ही स्थान पर माना जा सकता है। यह नियम मनमाना नहीं था; इसे जैविक नियंत्रणों (biological controls) से सीधे प्राप्त किया गया था, जिससे यह सुनिश्चित हुआ कि विधि वास्तव में साथ रहने वाले और केवल पास से गुजरने वाले रिसेप्टर्स के बीच अंतर कर सके।
इस पद्धति के साथ, शोधकर्ताओं ने दो तरीकों से मोटर न्यूरॉन्स का परीक्षण किया। पहले, उन्होंने लार्वा के रीढ़ की हड्डी के पिछले हिस्से में तंत्रिका तंतुओं (nerve fibers) के सामान्य नेटवर्क को देखा, जो एक ऐसा क्षेत्र है जहाँ कई कनेक्शन होते हैं। फिर, उन्होंने विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स की शाखाओं पर ध्यान केंद्रित किया, जो तंत्रिकाओं से संकेत प्राप्त करने वाले भाग हैं। उन्होंने पाया कि रिसेप्टर्स की व्यवस्था यादृच्छिक (random) नहीं थी। सामान्य तंत्रिका नेटवर्क में, विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर्स अक्सर एक ही स्थानों पर पाए जाते थे, जो एक मिश्रित वातावरण का सुझाव देते हैं। हालाँकि, जब उन्होंने विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स की शाखाओं के भीतर देखा, तो पैटर्न बदल गया। कुछ रिसेप्टर प्रकार एक साथ पाए गए, जबकि अन्य को अलग-अलग डोमेन में रखा गया। यह सुझाव देता है कि न्यूरॉन अपने आणविक घटकों को सक्रिय रूप से व्यवस्थित करता है, कुछ प्रकार के रिसेप्टर्स को एक साथ रखता है और दूसरों को अलग रखता है, यह इस पर निर्भर करता है कि वे कहाँ स्थित हैं।
यह अध्ययन पुष्टि करता है कि इन रिसेप्टर्स का स्थानिक संगठन (spatial organization) यह कैसे काम करता है, इसके लिए एक प्रमुख विशेषता है। यह दर्शाता है कि केवल यह जानना पर्याप्त नहीं है कि कौन से न्यूरॉन्स जुड़े हुए हैं; आपको कनेक्शन बिंदुओं के आणविक लेआउट को भी समझना होगा। शोधकर्ताओं ने यह दावा नहीं किया कि ये रिसेप्टर्स भौतिक रूप से एक एकल कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए आपस में जुड़ जाते हैं, बल्कि यह कि वे कोशिका की सतह पर एक ही छोटे पड़ोस में स्थित होते हैं। यह अंतर महत्वपूर्ण है क्योंकि इसका अर्थ है कि कोशिका इन रिसेप्टर्स को कहाँ रखा जाता है, इसे नियंत्रित करके विभिन्न संकेतों को विनियमित कर सकती है। उनके द्वारा बनाई गई विधि केवल फल मक्खियों या इन विशिष्ट रिसेप्टर्स तक सीमित नहीं है; इसे मस्तिष्क में किसी भी सूक्ष्म, बिखरे हुए प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। चमकते बिंदुओं की एक धुंधली छवि को सटीक तीन-आयामी वस्तुओं की गिनती में बदलकर, टीम ने तंत्रिका तंत्र के आणविक भूगोल को समझने के लिए एक नया उपकरण प्रदान किया है, जो यह प्रकट करता है कि मस्तिष्क की वायरिंग उसके भागों के प्लेसमेंट (स्थापना) के बारे में उतनी ही है जितने कि उनके बीच के कनेक्शनों के बारे में।
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