Mass spectrometric identification of a PSI-LHCI-cytochrome b6f complex in both Arabidopsis stn7 and pph1
यह अध्ययन *Arabidopsis* के stn7 और pph1 म्यूटेंट्स में PSI-LHCI और साइटोक्रोम b6f दोनों घटकों वाले एक नवीन 720 kDa सुपरकॉम्प्लेक्स की पहचान और लक्षण वर्णन करने के लिए नेटिव PAGE, फ्री-फ्लो इलेक्ट्रोफोरेसिस और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के संयोजन का उपयोग करता है, जबकि साथ ही pph1 जीनोटाइप के लिए विशिष्ट एक विशिष्ट 753 kDa फॉस्फोराइलेटेड LHCII-युक्त कॉम्प्लेक्स को भी प्रकट करता है।
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पौधे अनुकूलन के उस्ताद हैं, जो दिन भर प्रकाश की गुणवत्ता में होने वाले बदलावों के अनुसार सूर्य के प्रकाश को कुशलतापूर्वक पकड़ने के लिए अपनी आंतरिक कार्यप्रणाली को लगातार समायोजित करते हैं। ऐसा करने के लिए, वे दो विशाल आणविक मशीनों पर भरोसा करते हैं जिन्हें फोटोसिस्टम कहा जाता है, जो उनकी कोशिकाओं की झिल्लियों में अंतर्निहित सौर पैनलों की तरह कार्य करती हैं। जब प्रकाश बदलता है, तो पौधों को ऊर्जा के प्रवाह को संतुलित रखने के लिए इन दोनों मशीनों के बीच अपने ऊर्जा-संग्रहण एंटीना (antennas) को पुनर्वितरित करना पड़ता है। यह प्रक्रिया, जिसे 'स्टेट ट्रांजिशन' (state transition) कहा जाता है, इसमें प्रोटीनों का एक विशिष्ट समूह एक मशीन से अलग होकर दूसरी मशीन से जुड़ जाता है। दशकों से, वैज्ञानिक समझते आए हैं कि एक फॉस्फेट समूह नामक रासायनिक टैग एक स्विच के रूप में कार्य करता है, जो इन एंटीना को बताता है कि उन्हें कब हिलना है। हालाँकि, इस गति के दौरान बनने वाले अस्थायी पुलों की सटीक भौतिक संरचना अब तक अज्ञात रही है, मुख्य रूप से इसलिए क्योंकि ये जुड़ाव बहुत नाजुक होते हैं और इन्हें बिना तोड़े अलग करना कठिन होता है।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने थैल क्रेस (thale cress) नामक सामान्य पौधे की दो उत्परिवर्ती (mutant) किस्मों का उपयोग करके इन क्षणिक कनेक्शनों की स्पष्ट तस्वीर लेने का प्रयास किया। एक उत्परिवर्ती में वह एंजाइम नहीं है जो फॉस्फेट टैग जोड़ता है, जबकि दूसरे में वह एंजाइम नहीं है जो इसे हटाता है। इन पौधों को विशिष्ट प्रकाश स्थितियों के तहत उगाकर, वैज्ञानिकों ने यह सुनिश्चित किया कि मोबाइल एंटीना या तो अपनी मूल स्थिति में फंसे रहे या स्थायी रूप से गलत मशीन से जुड़े रहे, जिससे यह प्रक्रिया प्रभावी रूप से दो अलग-अलग अवस्थाओं में 'फ्रीज' हो गई। इसके बाद उन्होंने पौधों की झिल्लियों को एक सौम्य डिटर्जेंट के साथ घोला जो प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के आकार को सुरक्षित रखता है, जिससे वे उन पूर्ण संरचनाओं का अध्ययन कर सके जैसा कि वे कोशिका में मौजूद थे।
शोधकर्ताओं ने इन विशाल आणविक संकलनों को अलग करने के लिए एक परिष्कृत दो-चरणीय छँटाई प्रक्रिया का उपयोग किया। सबसे पहले, उन्होंने 'फ्री-फ्लो इलेक्ट्रोफोरेसिस' नामक तकनीक का उपयोग किया, जो प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को उनके विद्युत आवेश (electrical charge) के आधार पर अलग करती है जब वे तरल की एक पतली परत से गुजरते हैं। इस चरण से पता चला कि दोनों उत्परिवर्ती पौधों में कॉम्प्लेक्स के विद्युत हस्ताक्षर (electrical signatures) भिन्न थे, जिससे पुष्टि हुई कि फॉस्फेट टैग की उपस्थिति या अनुपस्थिति ने प्रोटीनों के व्यवहार को बदल दिया। हालाँकि, केवल इस विधि से वैज्ञानिकों को यह पता नहीं चल सका कि कौन से प्रोटीन वास्तव में एक-दूसरे को छू रहे हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, उन्होंने अलग किए गए अंशों को एक दूसरे, अधिक पारंपरिक जेल पृथक्करण (gel separation) से गुजाराया जो अणुओं को उनके आकार के आधार पर छाँटता है। इस द्वि-आयामी दृष्टिकोण ने उन्हें प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के उन विशिष्ट बैंडों को अलग करने की अनुमति दी जो एक एकल चरण में स्पष्ट रूप से दिखाई देने के लिए बहुत अधिक मिश्रित थे।
इन अलग किए गए बैंडों का मास स्पेक्ट्रोमेट्री (mass spectrometry) के माध्यम से विश्लेषण करके—एक ऐसी विधि जो उनके आणविक टुकड़ों के वजन द्वारा प्रोटीनों की पहचान करती है—टीम ने एक महत्वपूर्ण खोज की। दोनों उत्परिवर्ती पौधों में, उन्हें लगभग 720 किलोडालटन (kilodaltons) का एक बड़ा, स्थिर कॉम्प्लेक्स मिला जिसमें फोटोसिस्टम I मशीन, उससे जुड़े एंटीना और साइटोक्रोम b6f कॉम्प्लेक्स नामक तीसरा घटक शामिल था। इस निष्कर्ष ने पुष्टि की कि ये तीन अलग-अलग आणविक मशीनें मिलकर एक एकल 'सुपर-कॉम्प्लेक्स' बना सकती हैं, एक ऐसी संरचना जिसकी इस विशिष्ट संयोजन में आशंका तो थी लेकिन निश्चित रूप से पुष्टि नहीं हुई थी।
अध्ययन ने एक दूसरा, थोड़ा बड़ा कॉम्प्लेक्स भी प्रकट किया जिसका वजन लगभग 753 किलोडालटन था, जो केवल उस उत्परिवर्ती पौधे में दिखाई दिया जहाँ फॉस्फेट टैग को हटाया नहीं जा सका था। इस बड़े ढांचे में वही फोटोसिस्टम I और साइटोक्रोम b6f घटक शामिल थे, लेकिन इसमें फॉस्फेट के साथ स्थायी रूप से टैग किए गए मोबाइल एंटीना प्रोटीन भी शामिल थे। इस बड़े कॉम्प्लेक्स पर इन एंटीना की उपस्थिति ने समझाया कि यह भारी क्यों था और विद्युत क्षेत्र में अलग तरह से क्यों चला। महत्वपूर्ण रूप से, शोधकर्ताओं ने पाया कि छोटे 720 किलोडटन वाले कॉम्प्लेक्स में मोबाइल एंटीना मौजूद नहीं थे, जिससे यह सिद्ध हुआ कि फॉस्फेट टैग ही वह विशिष्ट संकेत है जो इन एंटीना को फोटोसिस्टम की ओर आकर्षित करता है।
यह कार्य स्टेट ट्रांजिशन की भौतिक प्रकृति को स्पष्ट करता है, यह दिखाते हुए कि मोबाइल एंटीना केवल स्वतंत्र रूप से तैरते नहीं हैं; वे एक बड़े, भारी इकाई के रूप में सीधे फोटोसिस्टम से बंध जाते हैं। शोधकर्ताओं ने नोट किया कि दोनों कॉम्प्लेक्स के बीच आकार का अंतर एक पूर्ण एंटीना ट्राइमर (trimer) के द्रव्यमान से कम था, जिससे पता चलता है कि इन बड़ी अणुओं के जेल के माध्यम से घूमने का तरीका उनके कुल वजन के बजाय उनके आकार और जेल के छिद्रों से उनके फिट होने के तरीके पर अधिक निर्भर करता है। चार्ज सेपरेशन और साइज सेपरेशन को सटीक प्रोटीन पहचान के साथ जोड़कर, टीम ने एक ठोस मानचित्र प्रदान किया कि कैसे ये आणविक मशीनें एकत्रित होती हैं और परस्पर क्रिया करती हैं, जिससे बदलती दुनिया में पौधों द्वारा अपनी ऊर्जा प्राप्ति के प्रबंधन को समझने का एक स्पष्ट मार्ग प्रशस्त हुआ।
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