Localis-REX: a general protocol for time-resolved spatiofunctional profiling in live cells and C. elegans
Localis-REX एक सुलभ, सामान्य प्रोटोकॉल है जो प्रकाश-प्रेरित, स्थानीयकृत REM पल्स का उपयोग करके, न्यूनतम रूप से विचलित स्थितियों के तहत प्रोटिओमिक मैपिंग या कार्यात्मक रीडआउट के लिए विशिष्ट लक्ष्यों को कैप्चर करने हेतु, जीवित कोशिकाओं और *C. elegans* में जन्मजात प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफिलिक मेटाबोलाइट (REM) के प्रति संवेदनशील प्रोटीनों के समय-समाधानित (time-resolved), स्थानिक-कार्यात्मक प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है।
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प्रत्येक जीवित कोशिका के भीतर, एक निरंतर, शांत रासायनिक नाटक चलता रहता है। 'रिएक्टिव मेटाबोलाइट्स' (reactive metabolites) नामक अणु संदेशवाहक के रूप में कार्य करते हैं, जो ऐसे संकेत ले जाते हैं जो कोशिकाओं को बताते हैं कि उन्हें कैसे बढ़ना है, संक्रमण से कैसे लड़ना है, या तनाव के प्रति कैसे प्रतिक्रिया देनी है। ये संदेशवाहक अत्यधिक प्रतिक्रियाशील होते हैं; वे विशिष्ट प्रोटीनों को खोजने और उनसे जुड़ने की कोशिश करते हैं, ठीक वैसे ही जैसे एक चाबी अपने ताले को ढूंढ लेती है। जब वे जुड़ते हैं, तो वे प्रोटीन के व्यवहार को बदल देते हैं, जिससे एक ऐसी श्रृंखला शुरू होती है जो जीव को जीवित रखती है। हालाँकि, ये संदेशवाहक क्षणभंगुर और खतरनाक भी होते हैं। इनका उत्पादन बहुत कम मात्रा में होता है, ये केवल कुछ सेकंड तक रहते हैं, और कोशिका की अपनी सफाई करने वाली टीमों द्वारा जल्दी ही निष्प्रभावी कर दिए जाते हैं। क्योंकि वे इतनी तेज़ी से गायब हो जाते हैं और इतनी कम मात्रा में मौजूद होते हैं, इसलिए वैज्ञानिक उन्हें रंगे हाथों पकड़ने में संघर्ष करते रहे हैं। वे यह देखने में असमर्थ रहे हैं कि वे वास्तव में किन प्रोटीनों को छूते हैं, कोशिका के भीतर यह कहाँ होता है, या जब ये विशिष्ट रासायनिक संवाद होते हैं तो कोशिका कैसे प्रतिक्रिया करती है। इस दृश्य के बिना, जीवन के कार्य करने का एक बड़ा हिस्सा अंधेरे में छिपा हुआ है।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब इस छिपी हुई दुनिया को रोशन करने की एक विधि विकसित की है, जिससे वे जीवित जीवों के भीतर इन रासायनिक संवादों को वास्तविक समय में देख सकते हैं। वे अपनी इस तकनीक को 'लोकलिस-रेक्स' (Localis-REX) कहते हैं। संदेशवाहकों को उनके गायब होने से पहले पकड़ने की कोशिश करने के बजाय, शोधकर्ताओं ने एक नियंत्रित जाल स्थापित किया है। वे एक विशेष प्रोटीन टैग का उपयोग करते हैं, जिसे वे कोशिका के भीतर विशिष्ट स्थानों पर या एक छोटे कृमि (worm) के एक विशिष्ट अंग में लगाते हैं। इसके बाद वे रासायनिक संदेशवाहक का एक हानिरहित, सुप्त (dormant) संस्करण पेश करते हैं। जब वे टैग पर एक विशिष्ट प्रकाश चमकाते हैं, तो वह संदेशवाहक को तुरंत जगा देता है, जिससे वह ठीक वहीं मुक्त होता है जहाँ टैग स्थित है। क्योंकि यह मुक्ति एक पल के भीतर और एक बहुत छोटे क्षेत्र में होती है, इसलिए संदेशवाहक के पास अपने लक्ष्य को खोजने से पहले भटकने या साफ किए जाने का समय नहीं होता। शोधकर्ता फिर देख सकते हैं कि किन प्रोटीनों ने संदेशवाहक को पकड़ा और इसके परिणामस्वरूप कोशिका के साथ क्या हुआ।
शोधकर्ताओं ने इस दृष्टिकोण का परीक्षण दो बहुत अलग प्रणालियों में किया: एक डिश में उगाए गए मानव कोशिकाएं और छोटा गोलकृमि सी. एलिगेंस (C. elegans)। कृमियों में, उन्होंने आनुवंशिक निर्देशों का उपयोग करके गले की मांसपेशियों, आंत, या शरीर की दीवार जैसे विशिष्ट अंगों में जाल रखा। मानव कोशिकाओं में, उन्होंने केंद्रक (nucleus) या माइटोकॉन्ड्रिया जैसे विशिष्ट विभाजनों के भीतर जाल रखा। इसके बाद उन्होंने सुप्त रासायनिक संदेशवाहक पेश किया, जो 4-हाइड्रॉक्सीनोनिनल (4-hydroxynonenal) नामक अणु का एक रूप है। यह अणु शरीर में स्वाभाविक रूप से बनता है और तनाव प्रतिक्रियाओं में शामिल होने के लिए जाना जाता है, लेकिन उच्च मात्रा में यह विषाक्त भी होता है। केवल जाल के पास इसे मुक्त करने के लिए प्रकाश का उपयोग करके, शोधकर्ता पूरे जीव को ज़हरीला बनाए बिना एक प्राकृतिक तनाव संकेत का अनुकरण कर सके।
उन्होंने पाया कि कोशिका की प्रतिक्रिया पूरी तरह से इस बात पर निर्भर करती है कि संकेत कहाँ से शुरू होता है। जब संदेशवाहक को कृमि के एक हिस्से में छोड़ा गया, तो वह विशिष्ट प्रोटीनों के एक समूह से जुड़ा। जब दूसरे हिस्से में छोड़ा गया, तो वह पूरी तरह से अलग सेट से जुड़ा। इससे सिद्ध हुआ कि कोशिका इन रासायनिक संकेतों के साथ एक सामान्य अलार्म के रूप में व्यवहार नहीं करती है जो हर जगह एक साथ बजता है। इसके बजाय, प्रतिक्रिया अत्यधिक स्थानीयकृत (localized) होती है। कुछ प्रोटीन केवल तभी प्रतिक्रिया देते हैं जब संकेत उनके विशिष्ट पड़ोस में दिखाई देता है। शोधकर्ताओं ने यह भी खोजा कि संदेशवाहक को पकड़ने वाले कई प्रोटीन वे नहीं थे जिनकी वैज्ञानिक अपेक्षा कर रहे थे। इन प्रोटीनों की पहचान करने की विधि का उपयोग करके, उन्होंने सैकड़ों नए उम्मीदवारों को पाया जो पहले कभी इस प्रकार के रासायनिक संकेतन से नहीं जुड़े थे।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि ये निष्कर्ष वास्तविक हैं और केवल प्रयोग का दुष्प्रभाव नहीं हैं, शोधकर्ताओं ने कई तरीकों से अपने काम की जाँच की। उन्होंने अपने पाए गए प्रोटीनों की सूची की तुलना उन प्रोटीनों के मानचित्र से की जो उन क्षेत्रों में केवल उच्च संख्या में मौजूद होते हैं। उन्होंने पाया कि संदेशवाहक को पकड़ने वाले प्रोटीन केवल सबसे आम प्रोटीन नहीं थे; वे विशिष्ट उत्तरदाता (responders) थे जो सक्रिय रूप से संकेत की तलाश करते थे। उन्होंने कृमियों से लेकर मनुष्यों तक विभिन्न प्रजातियों में इन प्रोटीनों के आनुवंशिक कोड को भी देखा, और पाया कि संदेशवाहक को पकड़ने वाले प्रोटीनों के हिस्से लाखों वर्षों से अपरिवर्तित रहे हैं। यह सुझाव देता है कि ये अंतःक्रियाएं जीवन के कार्य करने के लिए मौलिक हैं और विकास के माध्यम से संरक्षित की गई हैं।
टीम ने यह भी देखा कि संदेशवाहक जारी करने के बाद कृमियों के साथ क्या हुआ। उन्होंने कृमियों के चलने, खाने और प्रजनन करने के तरीके में आए परिवर्तनों का अवलोकन किया। इन परिवर्तनों ने पुष्टि की कि रासायनिक संकेत केवल एक रासायनिक जिज्ञासा नहीं था बल्कि जैविक व्यवहार का एक शक्तिशाली चालक था। रासायनिक संकेत के विशिष्ट स्थान को उसके द्वारा छुए गए विशिष्ट प्रोटीनों और कृमि के शरीर में होने वाले परिवर्तनों से जोड़कर, शोधकर्ताओं ने एक स्थानीयकृत तनाव प्रतिक्रिया की पूर्ण तस्वीर तैयार की।
यह कार्य यह अध्ययन करने का एक नया तरीका प्रदान करता है कि कोशिकाएं कैसे संवाद करती हैं और तनाव के प्रति कैसे प्रतिक्रिया करती हैं। यह दर्शाता है कि रासायनिक संकेत का स्थान उतना ही महत्वपूर्ण है जितना कि स्वयं संकेत। इस तकनीक को सुलभ बनाया गया है, शोधकर्ताओं ने उल्लेख किया कि बिना किसी पूर्व अनुभव के एक छात्र, जिसे कृमियों या सेल कल्चर के साथ काम करने का कोई अनुभव नहीं था, पूरे प्रक्रम को सीखने और करने में सक्षम था। यह सुझाव देता है कि इस तकनीक को अन्य वैज्ञानिकों द्वारा अपने स्वयं के शोध में समान प्रश्नों की खोज के लिए व्यापक रूप से अपनाया जा सकता है। इन रासायनिक संवादों के कहाँ और कैसे होने का स्पष्ट दृश्य प्रदान करके, 'लोकलिस-रेक्स' उन बीमारियों को समझने के द्वार खोलता है जहाँ ये संकेत गलत हो जाते हैं, जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार या हृदय रोग, जहाँ इन प्रतिक्रियाशील अणुओं का संचय क्षति का कारण बनता है। शोधकर्ता आशा करते हैं कि इन अंतःक्रियाओं का मानचित्रण करके, वे अंततः कोशिकाओं को नुकसान से बचाने और हस्तक्षेप करने के नए तरीके खोज सकेंगे।
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