Design and evaluation of probe-capture sequencing for clinical Neisseria gonorrhoeae specimens
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि एक कस्टम-डिज़ाइन किया गया प्रोब-कैप्चर सीक्वेंसिंग मेथड जटिल क्लिनिकल मूत्र नमूनों से *Neisseria gonorrhoeae* डीएनए को प्रभावी ढंग से समृद्ध करता है, जो महामारी विज्ञान संबंधी निगरानी और सार्वजनिक स्वास्थ्य हस्तक्षेपों में सहायता के लिए उच्च-गुणवत्ता वाले, कल्चर-स्वतंत्र जीनोम असेंबली और प्रतिरोध का पता लगाने में सक्षम बनाता है।
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एक अकेले जीवाणु (बैक्टीरिया) के एक आबादी के माध्यम से कैसे घूमते हैं, इसे समझने के लिए वैज्ञानिकों को अक्सर उसके आनुवंशिक कोड को पढ़ने की आवश्यकता होती है, ठीक वैसे ही जैसे एक लाइब्रेरियन किसी कहानी को समझने के लिए किताब पढ़ता है। कई बैक्टीरिया के लिए, यह सीधा और सरल है: एक लैब तकनीशियन पेट्री डिश पर नमूने को तब तक उगाता है जब तक कि अनुक्रमण (सीक्वेंसिंग) के लिए पर्याप्त कोशिकाएं न हो जाएं। हालांकि, कुछ बैक्टीरिया प्रयोगशाला में उगाना बेहद कठिन होता है। ऐसा ही एक जीव Neisseria gonorrhoeae है, वह बैक्टीरिया जो गोनोरिया का कारण बनता है। क्योंकि यह बहुत 'फैसिटियस' (fastidious), या अपने वातावरण के प्रति बहुत चयनात्मक है, यह अक्सर कल्चर में बढ़ने से इनकार कर देता है, जिससे डॉक्टर और सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों के सामने एक अदृश्य क्षेत्र (ब्लिंड स्पॉट) बन जाता है। वे मानक परीक्षणों का उपयोग करके संक्रमण का पता तो लगा सकते हैं, लेकिन वे उन आनुवंशिक विवरणों को आसानी से नहीं देख पाते जो यह बताते हैं कि बैक्टीरिया कैसे फैल रहे हैं या क्या वे एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति प्रतिरोधी हो रहे हैं। इस जानकारी के बिना, प्रकोपों को ट्रैक करना या सही उपचार चुनना कठिन होता है।
शोधकर्ताओं के एक दल ने इस समस्या को हल करने के लिए रोगी के नमूनों से सीधे बैक्टीरिया के आनुवंशिक पदार्थ को खोजने का एक तरीका विकसित करके इस समस्या को सुलझाने का प्रयास किया, जिसमें उसे पहले से उगाने की आवश्यकता नहीं है। उन्होंने बीमारी से संक्रमित लोगों के मूत्र नमूनों पर ध्यान केंद्रित किया। इन नमूनों में, बैक्टीरिया का डीएनए अक्सर मानव डीएनए और शरीर में रहने वाले अन्य हानिरहित बैक्टीरिया के डीएनए के विशाल मात्रा के नीचे दबा होता है। इस घास के ढेर में सुई को खोजने के लिए, वैज्ञानिकों ने आणविक "हुक" (hooks) का एक कस्टम सेट डिजाइन किया। ये हुक आनुवंशिक पदार्थ के छोटे धागे हैं जिन्हें विशेष रूप से Neisseria gon orrhoeae के डीएनए से चिपकने के लिए इंजीनियर किया गया है। इन हुक्स का उपयोग करके, वे जटिल मिश्रण से बैक्टीरियल डीएनए को बाहर निकाल सकते थे और इसे उसकी पूरी आनुवंशिक कहानी पढ़ने के लिए पर्याप्त रूप से केंद्रित कर सकते थे।
शोधकर्ताओं ने एक विशाल आनुवंशिक डेटा लाइब्रेरी की जांच करके शुरुआत की। उन्होंने एक सार्वजनिक डेटाबेस से Neisseria gonorrhoeae के लगभग 33,000 विभिन्न संस्करणों के जीनोम डाउनलोड किए। ये जीनोम दुनिया भर के रोगियों से आए थे और बैक्टीरिया की विविधता की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करते थे। अपने हुक्स को सभी विभिन्न संस्करणों के खिलाफ प्रभावी बनाने के लिए, उन्हें यह चुनना था कि कौन से उपयोग किए जाएं। उन्होंने जीनोम को इस आधार पर समूहों में बांटा कि उनके कोर जीन कितने समान हैं और फिर उन्हें उनके विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध पैटर्न के आधार पर वर्गीकृत किया। इस विशाल संग्रह से, उन्होंने 2,877 प्रतिनिधि जीनोम चुने जो बैक्टीरिया की विविधता की पूरी सीमा को कवर करते थे। इनका उपयोग करके, उन्होंने 1,39,000 से अधिक अद्वितीय हुक्स का एक सेट डिजाइन किया, जिनमें से प्रत्येक 120 यूनिट लंबा था, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे बैक्टीरिया के लगभग किसी भी संस्करण को पकड़ सकें जो उन्हें मिल सकता है।
जब उन्होंने इस नई पद्धति का परीक्षण बारह वास्तविक दुनिया के मूत्र नमूनों पर किया, तो परिणाम आश्चर्यजनक थे। हुक्स का उपयोग करने से पहले, इन नमूनों में बैक्टीरियल डीएनए कुल आनुवंशिक सामग्री का एक बहुत छोटा हिस्सा था, जो अक्सर एक प्रतिशत से भी कम था। कैप्चर प्रक्रिया के बाद, बैक्टीरियल डीएनए की मात्रा नाटकीय रूप से बढ़ गई, कुछ मामलों में 200 गुना से अधिक और कुछ में 2,000 गुना तक। इस संवर्धन (enrichment) ने शोधकर्ताओं को बारह में से नौ नमूनों से बैक्टीरिया के पूर्ण आनुवंशिक कोड को पुनर्गठित करने की अनुमति दी। यहाँ तक कि उन नमूनों में भी जहाँ बैक्टीरिया की संख्या बहुत कम थी, इस पद्धति ने पर्याप्त आनुवंशिक सामग्री को सफलतापूर्वक प्राप्त किया जिससे एक लगभग पूर्ण जीनोम बनाया जा सका। इसका अर्थ था कि वे विशिष्ट प्रकार के बैक्टीरिया की पहचान कर सकते थे और महत्वपूर्ण रूप से, उन आनुवंशिक उत्परिवर्तनों (mutations) को देख सकते थे जो उन्हें एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति प्रतिरोधी बनाते हैं।
अध्ययन ने पुष्टि की कि यह दृष्टिकोण उन नैदानिक नमूनों के लिए काम करता है जिनका विश्लेषण करना कठिन है। शोधकर्ताओं ने पाया कि उनके कस्टम हुक्स ने बैक्टीरिया के जीनोम का 94.6 प्रतिशत और लगभग सभी ज्ञात जीन को कवर किया। वे प्रमुख दवाओं के लिए प्रतिरोध पैटर्न का पता लगाने में सक्षम थे, जिनमें वे दवाएं भी शामिल थीं जिनका उपयोग संक्रमण के इलाज के लिए किया जाता है। हालांकि यह विधि मध्यम से उच्च मात्रा वाले नमनों पर सबसे अच्छा काम करती थी, लेकिन इसने बहुत कम मात्रा वाले नमूनों के लिए भी मूल्यवान डेटा प्रदान किया, हालांकि उनसे प्राप्त आनुवंशिक मानचित्र थोड़े खंडित (fragmented) थे। टीम ने उल्लेख किया कि जीनोम के कुछ विशिष्ट हिस्से, जैसे कि कुछ राइबोसोमल आरएनए जीन, पकड़ना कठिन थे, जो यह सुझाव देते हैं कि भविष्य में हुक्स में सुधार किया जा सकता है।
यह कार्य दर्शाता है कि बैक्टीरिया के प्रसार और विकास को समझने के लिए उन्हें कल्चर करने की आवश्यकता को दरकिनार करना संभव है। रोगी के नमूनों से सीधे आनुवंशिक सामग्री को समृद्ध करके, सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारी अब बीमारी को अधिक सटीक रूप से ट्रैक कर सकते हैं और दवा-प्रतिरोधी उपभेदों (strains) की तेजी से पहचान कर सकते हैं। शोधकर्ता सुझाव देते हैं कि इस तकनीक को अन्य कठिन-से-उगाने वाले रोगजनकों (pathogens) पर लागू किया जा सकता है, जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध के बढ़ते खतरे वाली दुनिया में संक्रामक रोगों की निगरानी के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है। प्रयोगशाला में उगाने के मध्यवर्ती चरण के बिना, रोगी के शरीर से सीधे रोगजनक की आनुवंशिक कहानी को पढ़ने की क्षमता, इन अदृश्य शत्रुओं की निगरानी और प्रबंधन करने के तरीके में एक महत्वपूर्ण प्रगति है।
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