Base Editing-Mediated Exon-Specific Knockout 1 of Glutamine Synthetase Generates a High-Productivity CHO Cell Line for Antibody Manufacturing
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि ग्लूटामिन सिंथेटेस जीन के एक्सॉन 7 में एक प्रीमैच्योर टर्मिनेशन कोडोन पेश करने के लिए बेस एडिटिंग का उपयोग करना एक पूर्ण नॉकआउट बनाता है जो एंटीबॉडी निर्माण के लिए एक उच्च-व्यवहार्यता, उच्च-उत्पादकता वाली CHO सेल लाइन प्रदान करता है, जिससे यह पता चलता है कि टर्मिनेशन कोडोन की स्थिति कोशिकीय फेनोटाइप का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है।
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कल्पना कीजिए कि आप जीवन रक्षक दवाएं बनाने के लिए एक विशाल, हाई-टेक फैक्ट्री बनाने की कोशिश कर रहे हैं। जैव प्रौद्योगिकी (biotechnology) की दुनिया में, इस काम के लिए सबसे लोकप्रिय "मजदूर" सूक्ष्म कोशिकाएं हैं जिन्हें CHO सेल्स (चीनी हैमस्टर ओवरी सेल्स) कहा जाता है। ये कोशिकाएं सूक्ष्म कारखानों की तरह हैं जिन्हें कैंसर से लड़ने वाले एंटीबॉडी जैसे जटिल प्रोटीन बनाने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। लेकिन एक पेंच है: ये कोशिकाएं स्वाभाविक रूप से खाने के मामले में बहुत नखरेबाज होती हैं। उन्हें जीवित रहने और कड़ी मेहनत करने के लिए ग्लूटामिन (glutamine) नामक एक विशिष्ट पोषक तत्व की आवश्यकता होती है। यदि आप उनसे ग्लूटामिन छीन लेते हैं, तो वे आमतौर पर बढ़ना बंद कर देती हैं या मर जाती हैं।
इन कोशिकाओं को अधिक दवा बनाने के लिए प्रेरित करने हेतु, वैज्ञानिक एक चतुर तकनीक का उपयोग करते हैं जिसे "ग्लूटामिन सिंथेटेज़" (GS) सिस्टम कहा जाता है। GS सिस्टम को एक जेनेटिक स्विच की तरह समझें। वैज्ञानिक कोशिका की ग्लूटामिन बनाने की अपनी क्षमता को नष्ट कर देते हैं (GS जीन को तोड़कर)। अब, कोशिका भूखी और बेहाल है। जब वैज्ञानिक उस दवा के लिए जीन पेश करते हैं जिसे वे बनाना चाहते हैं, तो वे कोशिका को एक "रेस्क्यू किट" (एक काम करने वाला GS जीन) भी देते जो दवा के जीन से जुड़ा होता है। कोशिका को चुनना होगा: या तो वह दवा बनाएगी और अपना भोजन वापस पाएगी, या वह भूख से मर जाएगी। यह कोशिका को एक सुपर-प्रोड्यूसर बनने के लिए मजबूर करता है। हालांकि, वैज्ञानिकों ने देखा है कि इनमें से कुछ "भूखी" सेल फैक्ट्रियां दूसरों की तुलना में बहुत बेहतर काम करती हैं, और बहुत अधिक दवा बनाती हैं। बड़ा सवाल यह है कि क्यों? क्या यह सिर्फ किस्मत है, या इस बारे में कोई छिपा हुआ नियम है कि मूल जीन को कैसे तोड़ा जाता है जो यह निर्धारित करता है कि फैक्ट्री कितनी अच्छी बनेगी?
यह शोध पत्र इस रहस्य की गहराई में जाता है और GS जीन को एक लंबे निर्देश मैनुअल की तरह मानता है जिसमें कई अध्याय (जिन्हें एक्सॉन कहा जाता है) हैं। शोधकर्ता यह देखना चाहते थे कि क्या यह मायने रखता है कि आपने ग्लूटामिन बनाने के लिए मूल जीन के किस अध्याय को फाड़ा है। उन्होंने एक अत्यंत सटीक जेनेटिक टूल का उपयोग किया जिसे "बेस एडिटिंग" (base editing) कहा जाता है, जो एक वर्ड प्रोसेसर के "फाइंड एंड रिप्लेस" फंक्शन की तरह काम करता है। पूरे पेज को फाड़ने के बजाय (जिससे DNA में गंदे निशान या टूट-फूट हो सकती है), उन्होंने केवल कोड के एक एकल अक्षर को बदलकर अलग-अलग अध्यायों में एक "स्टॉप" साइन (एक समयपूर्व समाप्ति कोड या प्रीमैच्योर टर्मिनेशन कोड) बना दिया।
टीम ने GS जीन के हर एक अध्याय में इन "स्टॉप" संकेतों का परीक्षण किया, अध्याय 2 से लेकर अध्याय 7 तक। उन्होंने पाया कि यह वास्तव में मायने रखता है कि आप स्टॉप साइन कहाँ रखते हैं। यदि आप स्टॉप साइन शुरुआती अध्यायों (जैसे अध्याय 2 या 6) में रखते हैं, तो कोशिका की आंतरिक मशीनरी कभी-कभी इसे अनदेखा कर देती है या अपने टूटे हुए निर्देशों को इधर-उधर तैरते रहने देती है, जिससे कोशिका के पास ग्लूटामिन बनाने की थोड़ी सी पुरानी क्षमता बनी रहती है। यह सामने के दरवाजे पर "प्रवेश निषेध" का साइन लगाने जैसा है; डिलीवरी ट्रक शायद ही इसे अनदेखा कर आगे बढ़ जाएं।
हालांकि, जब उन्होंने अध्याय 7 में "स्टॉप" साइन लगाया (विशेष रूप से R286X नामक स्थान पर), तो परिणाम एक पूर्ण शटडाउन था। कोशिका ने ग्लूटामिन बनाने की अपनी क्षमता पूरी तरह से खो दी, और टूटे हुए निर्देशों को पूरी तरह से हटा दिया गया। इस विशिष्ट सेल लाइन को, जिसे शोधकर्ता "E7" कहते हैं, एक सुपरस्टार के रूप में पाया गया। जब उन्होंने एक एंटीबॉडी (एक प्रकार की दवा) बनाने के लिए एक बड़े टैंक में इन कोशिकाओं का परीक्षण किया, तो E7 कोशिकाएं न केवल जीवित रहीं; बल्कि वे फलती-फूलती भी रहीं। वे मानक वाणिज्यिक कोशिकाओं की तुलना में अधिक समय तक जीवित रहीं और काफी अधिक दवा बनाई। वास्तव में, बिना किसी अतिरिक्त मदद के, E7 कोशिकाओं ने मानक "Merck CHOZN" कोशिकाओं की तुलना में प्रति कोशिका तीन गुना से अधिक मात्रा में दवा का उत्पादन किया। जब वैज्ञानिकों ने कोशिकाओं को और अधिक मेहनत करने के लिए मजबूर करने हेतु थोड़ा सा दबाव (MSX नामक एक रसायन) डाला, तो E7 कोशिकाओं ने अपने आउटपुट को और भी बढ़ा दिया, जो 1.02 ग्राम प्रति लीटर के टिटर (titer) तक पहुँच गया।
शोधकर्ताओं ने यह भी जांचा कि क्या उन्होंने गलती से कोशिका के DNA में कुछ और नहीं तोड़ दिया है। उन्होंने पाया कि एडिटिंग अविश्वसनीय रूप से साफ-सुथरी थी, जिसमें लगभग कोई अनचाहा दुष्प्रभाव नहीं था, जिससे पुष्टि हुई कि यह "अध्याय 7" की रणनीति सुरक्षित और विश्वसनीय है। उन्होंने इस विचार को भी खारिज कर दिया कि एक बैकअप जीन (जिसे GS1 कहा जाता है) कोशिकाओं की मदद कर रहा था; भले ही बैकअप जीन अभी भी पूरी तरह से काम कर रहा था, फिर भी E7 कोशिकाएं चैंपियन की तरह प्रदर्शन करती रहीं।
संक्षेप में, यह शोध पत्र सुझाव देता है कि जेनेटिक "स्टॉप" साइन का स्थान ही असली गुप्त सूत्र (secret sauce) है। जेनेटिक "स्टॉप" साइन को सही जगह (अध्याय 7) पर रखकर, वैज्ञानिक एक ऐसी सेल फैक्ट्री बना सकते हैं जो न केवल उनकी रेस्क्यू किट पर पूरी तरह निर्भर है, बल्कि अविश्वसनीय दक्षता के साथ काम भी करती है। यह खोज बेहतर सेल लाइन्स बनाने के लिए एक नया, स्पष्ट ब्लूप्रिंट प्रदान करती है, जिससे उन दवाओं के तेजी से और सस्ते उत्पादन की संभावना बढ़ सकती है जिन पर हम भरोसा करते हैं।
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