A Sensitive and Specific One-step TaqMan RT-qPCR Assay for Rapid Detection of Enterovirus C99

आंतों को संक्रमित करने वाले वायरस हमारी दुनिया में एक निरंतर, अदृश्य उपस्थिति हैं। इनमें सबसे आम एंटरोवायरस (enteroviruses) हैं, जो नन्हे, गैर-लिफाफा युक्त (non-enveloped) कणों का एक बड़ा परिवार है जो अपने आनुवंशिक निर्देशों को आरएनए (RNA) के एक एकल स्ट्रैंड पर ले जाते हैं। जबकि इनमें से कई वायरस केवल हल्की बीमारी का कारण बनते हैं, कुछ गंभीर न्यूरोलॉजिकल समस्याओं या पक्षाघात (paralysis) का कारण बन सकते हैं। क्योंकि ये वायरस तेजी से उत्परिवर्तित (mutate) होते हैं और अक्सर एक-दूसरे के साथ आनुवंशिक सामग्री का आदान-प्रदान करते हैं, वे लगातार विकसित हो रहे हैं, जिससे उन्हें ट्रैक करना कठिन हो जाता है। इस विशाल परिवार के भीतर, एंटरोवायरस सी (Enterovirus C) नामक एक विशिष्ट समूह के अंतर्गत कई प्रकार शामिल हैं, जिनमें प्रसिद्ध पोलियोवायरस और एक नया, उभरता हुआ सदस्य एंटरोवायरस सी99 (Enterovirus C99) भी शामिल है। यह विशिष्ट वायरस मनुष्यों और अन्य जानवरों में कई देशों में पाया गया है, जिससे प्रजातियों के बीच कूदने और पर्यावरण में चुपचाप फैलने की इसकी क्षमता के बारे में चिंताएं बढ़ गई हैं। इसे जल्दी और सटीक रूप से पहचानना सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है, फिर भी इसे खोजने के लिए उपलब्ध उपकरण अक्सर धीमे, त्रुटियों के प्रति संवेदनशील होते हैं और विस्तृत और समय लेने वाले फॉलो-अप कार्य के बिना इस विशिष्ट वायरस को इसके कई 'कजिन्स' (समान वायरस) से अलग करने में असमर्थ होते हैं।

इस समस्या को हल करने के लिए, हैनान यूनिवर्सिटी और ग्वांगडोंग प्रांतीय रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र के शोधकर्ताओं के एक दल ने एंटरोवायरस सी99 को खोजने का एक बेहतर तरीका बनाने का लक्ष्य रखा। उन्होंने वायरस के आनुवंशिक कोड के एक विशिष्ट हिस्से पर ध्यान केंद्रित किया, जो वीपी1 (VP1) नामक जीन के भीतर एक क्षेत्र है जो इस विशेष वायरस प्रकार के लिए एक अद्वितीय फिंगरप्रिंट की तरह कार्य करता है। इस लक्ष्य का उपयोग करते हुए, उन्होंने एक नया परीक्षण डिजाइन किया जो आनुवंशिक सामग्री की नकल करने (copying) और उसे मापने की प्रक्रिया को एक एकल, सुव्यवस्थित चरण में जोड़ता है। यह विधि, जिसे वन-स्टेप टैकमैन आरटी-क्यूपीसीआर (one-step TaqMan RT-qPCR) परख कहा जाता है, एक विशेष प्रोब (probe) का उपयोग करके काम करती है जो केवल तभी चमकता है जब उसे एंटरोवायरस सी99 का सटीक आनुवंशिक अनुक्रम मिलता है। पुराने तरीकों के विपरीत, जिनमें परिणाम देखने के लिए प्रतिक्रिया के बाद टेस्ट ट्यूब को खोलना आवश्यक होता है, यह नया दृष्टिकोण प्रतिक्रिया के दौरान वास्तविक समय (real time) में वायरस का पता लगाता है, जिससे नमूना सीलबंद रहता है और संदूषण (contamination) का जोखिम कम हो जाता है।

शोधकर्ताओं को सबसे पहले अपने परीक्षण के घटकों को ठीक करना था ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह पूरी तरह से काम करे। उन्होंने रासायनिक प्राइमरों और प्रोब की विभिन्न मात्राओं के साथ प्रयोग किया, और अंततः एक विशिष्ट संयोजन पर समझौता किया जिसने सबसे मजबूत और विश्वसनीय संकेत उत्पन्न किया। अनुकूलित होने के बाद, उन्होंने नए परीक्षण का अन्य विविध एंटरोवायरस, जिनमें कॉक्सैकीवायरस (Coxsackievirus), इकोवायरस (Echovirus) और पोलियोवायरस शामिल हैं, के विरुद्ध परीक्षण किया, ताकि यह देखा जा सके कि क्या वे एंटरोवायरस सी99 के रूप में गलत पहचान करेंगे। परिणाम स्पष्ट थे: परीक्षण केवल तभी चमका जब एंटरोवायरस सी99 मौजूद था। इसने अन्य प्रत्येक वायरस को अनदेखा कर दिया, जिससे यह सिद्ध हुआ कि नया उपकरण अत्यधिक विशिष्ट है और इससे कोई गलत अलार्म उत्पन्न नहीं होगा।

संवेदनशीलता (Sensitivity) अगला बड़ा अवरोध था। टीम जानना चाहती थी कि परीक्षण वायरस की कितनी न्यूनतम मात्रा का पता लगा सकता है। उन्होंने वायरस की आनुवंशिक सामग्री की घटती मात्रा वाले नमूनों की एक श्रृंखला बनाई, जो अत्यंत सूक्ष्म सांद्रता तक नीचे गई। नया परीक्षण वायरस की पहचान तब भी सफलतापूर्वक कर सका जब वहां लगभग 0.366 प्रतियां प्रति माइक्रोलिटर तरल मौजूद थीं। प्रत्यक्ष तुलना में, प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले पुराने, पारंपरिक तरीके केवल तब वायरस को देख सकते थे जब सांद्रता सौ गुना अधिक होती थी। इसका अर्थ है कि नया परीक्षण सौ गुना अधिक संवेदनशील है, जो वायरस को तब भी पकड़ने में सक्षम है जब वह बहुत कम संख्या में मौजूद हो, जिसे अन्यथा अनदेखा कर दिया जाता। परीक्षण अत्यंत सुसंगत भी साबित हुआ; जब शोधकर्ताओं ने एक ही नमूने को कई बार चलाया, तो परिणाम दो प्रतिशत से भी कम भिन्न थे, जो दर्शाता है कि यह विधि स्थिर और विश्वसनीय है।

यह देखने के लिए कि परीक्षण वास्तविक दुनिया में कैसा प्रदर्शन करता है, शोधकर्ताओं ने 2024 और 2025 के बीच ग्वांगडोंग प्रांत के सीवेज उपचार संयंत्रों से एकत्र किए गए बानवे (92) अपशिष्ट जल नमूनों पर इसे लागू किया। इन नमूनों को पहले से ही किसी प्रकार के एंटरोवायरस के मौजूद होने के रूप में चिह्नित किया गया था, लेकिन विशिष्ट प्रकार अज्ञात था। नए परीक्षण ने सभी बानवे नमूनों को स्कैन किया और एक ऐसा नमूना पाया जिसमें एंटरोवायरस सी99 मौजूद था। यह एकल सकारात्मक परिणाम केवल एक प्रतिशत से थोड़ा अधिक डिटेक्शन रेट का प्रतिनिधित्व करता था। पूरी तरह से आश्वस्त होने के लिए, शोधकर्ताओं ने उस सकारात्मक नमूने को एक मानक अनुक्रमण (sequencing) प्रक्रिया के माध्यम से चलाया, जो आनुवंशिक कोड को अक्षर दर अक्षर पढ़ता है। उस अनुक्रम ने पुष्टि की कि वायरस वास्तव में एंटरोवायरस सी99 था, जो नए तीव्र परीक्षण के परिणाम से पूरी तरह मेल खाता था। आनुवंशिक सामग्री निकालने से लेकर परिणाम प्राप्त करने तक की पूरी प्रक्रिया में लगभग दो घंटे लगे, जो पारंपरिक तरीकों (जिनमें कई चरण और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस शामिल है) के लिए आवश्यक चार से छह घंटों की तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार है।

यह कार्य प्रदर्शित करता है कि एंटरोवायरस सी99 का पता लगाने के लिए एक तेज़, सटीक और अत्यधिक संवेदनशील उपकरण अब उपलब्ध है। एक विशिष्ट आनुवंशिक हस्ताक्षर को लक्षित करके और एक वास्तविक समय पहचान प्रणाली का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने एक ऐसी विधि बनाई है जो इस उभरते हुए वायरस की पहचान अन्य समान वायरसों के भ्रम के बिना तेजी से कर सकती है। हालांकि अध्ययन में अपशिष्ट जल के परीक्षण में केवल एक सकारात्मक नमूना मिला, लेकिन इतने निम्न स्तर पर वायरस का पता लगाने की क्षमता और इसकी गति प्रदान करती है, जो निगरानी के लिए एक शक्तिशाली नई क्षमता प्रदान करती है। यह उपकरण सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों को पर्यावरण में इसके प्रसार को ट्रैक करने और संभावित रूप से प्रकोपों को जल्दी पकड़ने में मदद करने का एक तरीका प्रदान करता है, जिससे इस विकसित होते रोगजनक (pathogen) के जोखिमों को प्रबंधित करने में सहायता मिलती है।