Comparative Evaluation of Five Proteases for the Production of Multifunctional Bioactive Peptides from Chickpea (Cicer arietinum L.) Protein Isolate: Optimization of Hydrolysis Conditions, Peptide Characterization, and In Vitro Assessment of ACE-Inhibitory, DPP-IV-Inhibitory, and Antioxidant Activities

अपने शरीर की कल्पना एक हलचल भरे शहर के रूप में करें जहाँ ट्रैफिक लाइट और पावर प्लांट सब कुछ सुचारू रूप से चलाने के लिए काम करते हैं। हालाँकि, कभी-कभी ट्रैफिक लाइट "रुकें" (stop) पर अटक जाती है, जिससे दबाव का खतरनाक संचय (उच्च रक्तचाप) हो जाता है, या पावर प्लांट भ्रमित हो जाते हैं, जिससे सड़कों पर चीनी (मधुमेह) की बाढ़ आ जाती है। दशकों से, डॉक्टर इन टूटे हुए लाइटों और पावर प्लांट को ठीक करने के लिए सिंथेटिक दवाओं का उपयोग करते आए हैं, लेकिन ये रासायनिक चाबियाँ कभी-कभी लगातार खांसी या पेट की समस्या जैसे दुष्प्रभाव पैदा कर सकती हैं। इसने हमारे रसोईघरों में छिपे एक सौम्य, प्राकृतिक विकल्प की खोज को जन्म दिया है: बायोएक्टिव पेप्टाइड्स। इन पेप्टाइड्स को हमारे द्वारा खाए जाने वाले प्रोटीन, जैसे कि चने, के भीतर बंद छोटे, एन्क्रिप्टेड संदेशों के रूप में सोचें। वे तब तक हानिरहित होते हैं जब तक कि एक विशिष्ट कुंजी—एक प्रोटीज एंजाइम—उन्हें अनलॉक नहीं करती। एक बार मुक्त होने के बाद, ये छोटे संदेशवाहक शरीर में तैर सकते हैं और प्राकृतिक ट्रैफिक नियंत्रकों की तरह कार्य कर सकते हैं, रक्तचाप को शांत कर सकते हैं और शुगर के स्तर को प्रबंधित करने में मदद कर सकते हैं, साथ ही हानिकारक जंग (ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस) के खिलाफ छोटे बॉडीगार्ड के रूप में भी कार्य कर सकते हैं।

बड़ा सवाल जो वैज्ञानिक पूछ रहे हैं: कौन सी कुंजी इन संदेशों को अनलॉक करने के लिए सबसे अच्छी है? हालांकि हम जानते हैं कि एंजाइम इन पेप्टाइड्स को मुक्त कर सकते हैं, लेकिन यह देखने के लिए कि कौन सा सबसे अच्छा काम करता है, कोई स्पष्ट आमने-सामने की दौड़ नहीं हुई थी कि चने के लिए कौन सा सबसे उपयुक्त है, जो दुनिया के तीसरे सबसे लोकप्रिय दलहन हैं। यह अध्ययन उस अखाड़े में कदम रखता है ताकि चने के प्रोटीन के लिए सर्वोत्तम "कुंजी" को खोजा जा सके, जिसमें पांच अलग-अलग खाद्य-ग्रेड एंजाइमों का परीक्षण किया गया है ताकि यह देखा जा सके कि कौन सा सबसे शक्तिशाली, बहु-कार्यकारी बायोएक्टिव पेप्टाइड्स को अनलॉक कर सकता है।

महान एंजाइम दौड़

इस अध्ययन में, शोधकर्ताओं ने चना प्रोटीन आइसोलेट (डेसी-प्रकार के चने, विशेष रूप से 'पंजाब-2008' किस्म से बना एक केंद्रित प्रोटीन पाउडर) लिया और इसे पांच अलग-अलग एंजाइमेटिक "कैंची" को सौंपा ताकि यह देखा जा सके कि कौन सा प्रोटीन को सबसे उपयोगी छोटे टुकड़ों में काट सकता है। प्रतियोगी थे: Alcalase, Flavourzyme, papain, trypsin, और Neutrase।

परिणाम स्पष्ट थे: Alcalase निर्विवाद विजेता था। जबकि सभी एंजाइमों ने कुछ कटिंग की, Alcalase ने प्रोटीन को सबसे अधिक गहराई से काटा, जिससे "डिग्री ऑफ हाइड्रोलेसिस" (यह मापने का एक तरीका कि प्रोटीन को कितना तोड़ा गया है) 28.4 ± 1.1% प्राप्त हुआ। अन्य एंजाइम पीछे रह गए, जिसमें papain 22.3 ± 0.9%, Neutrase 21.5 ± 1.0%, Flavourzyme 19.7 ± 0.8%, और trypsin 16.8 ± 0.7% के मामूली स्तर पर था।

लेकिन प्रोटीन को काटना केवल उसे छोटा बनाने के बारे में नहीं था; यह उसे उपयोगी बनाने के बारे में था। Alcalase द्वारा बनाया गया हाइड्रोलेट (छोटे पेप्टाइड्स का सूप), जिसे शोधकर्ताओं ने CPI-ALC नाम दिया, एक ट्रिपल-थ्रेट सुपरहीरो साबित हुआ। इसने सबसे मजबूत क्षमता दिखाई:

• ACE (एंजियोटेंसिन-आई-कन्वर्टिंग एंजाइम) को ब्लॉक करना: रक्तचाप बढ़ाने में एक प्रमुख खिलाड़ी। CPI-ALC की IC₅₀ 0.34 ± 0.02 mg/mL थी। (सरल शब्दों में, यह एंजाइम की आधी गतिविधि को रोकने के लिए आवश्यक मात्रा है; कम संख्या का अर्थ है कि यह अधिक शक्तिशाली है)।
• DPP-IV (डायपेप्टिडिल पेप्टिडेज़-IV) को ब्लॉक करना: एक एंजाइम जो इंसुलिन को नियंत्रित करने वाले हार्मोन को तोड़ता है। इसकी IC₅₀ 0.82 ± 0.04 mg/mL थी।
• फ्री रेडिकल्स को खत्म करना: एक एंटीऑक्सीडेंट के रूप में कार्य करना। 1 mg/mL की सांद्रता पर, इसने 68.5 ± 2.3% हानिकारक DPPH रेडिकल्स को बेअसर कर दिया।

अन्य एंजाइमों द्वारा निर्मित हाइड्रोलेट्स अच्छे थे, लेकिन उनमें से कोई भी Alcalase टीम की सर्वव्यापी शक्ति का मुकाबला नहीं कर सका।

सही संतुलन खोजना

एक बार जब उन्हें पता चल गया कि Alcalase विजेता है, तो शोधकर्ता वहीं नहीं रुके। वे इससे अधिकतम लाभ उठाने के लिए एक आदर्श रेसिपी खोजना चाहते थे। रिस्पॉन्स सरफेस मेथोडोलॉजी (RSM) नामक एक परिष्कृत सांख्यिकीय मानचित्र का उपयोग करते हुए, उन्होंने तीन चरों (variables) में बदलाव किया: एंजाइम की मात्रा, तापमान और काटने का समय।

उन्होंने पाया कि पूर्ण कट के लिए "गोल्डन ज़ोन" था:

• एंजाइम की मात्रा: 3.2% (प्रोटीन के वजन के मुकाबले एंजाइम का वजन)
• तापमान: 52°C
• समय: 180 मिनट

जब उन्होंने इस सटीक रेसिपी का परीक्षण किया, तो इसने बिल्कुल वैसा ही काम किया जैसा अनुमान था, जिससे 87.3 ± 1.5% का ACE निषेध (inhibition) प्राप्त हुआ। इसने पुष्टि की कि सही परिस्थितियों के साथ, आप इन सहायक पेप्टाइड्स के उत्पादन को अधिकतम कर सकते हैं।

आकार मायने रखता है

शोधकर्ताओं ने फिर एक "छलनी" का खेल खेला, जिसमें उन्होंने Alcalase के सूप को पेप्टाइड्स को उनके आकार के आधार पर अलग करने के लिए सूक्ष्म जालों के माध्यम से छाना। उन्होंने पाया कि सबसे छोटे टुकड़े सबसे शक्तिशाली थे। वह अंश जिसमें 1 kDa से छोटे पेप्टाइड्स थे (जो कुल द्रव्यमान का 42.3% हिस्सा था), स्पष्ट विजेता था।

यह छोटा अंश एक पावरहाउस था:

• इसने ACE गतिविधि को 82.6 ± 2.1% तक रोका।
• इसने DPP-IV गतिविधि को 75.4 ± 1.8% तक रोका।
• इसने 78.2 ± 2.4% DPPH रेडिकल्स को खत्म किया।

बड़े टुकड़े (5 kDa से अधिक) बहुत कमजोर थे, जिससे सिद्ध हुआ कि इन विशिष्ट स्वास्थ्य लाभों के लिए, "छोटा होना बेहतर है।" छोटे पेप्टाइड्स का आकार उन एंजाइमों के सक्रिय पॉकेटों में फिसलने के लिए बिल्कुल सही है जिन्हें वे रोकने की कोशिश कर रहे हैं।

आणविक जासूसी कार्य

यह समझने के लिए कि ये छोटे टुकड़े इतने प्रभावी क्यों थे, शोधकर्ताओं ने जीतने वाले <1 kDa अंश में अमीनो एसिड के विशिष्ट अनुक्रमों की पहचान करने के लिए LC-MS/MS नामक एक हाई-टेक माइक्रोस्कोप का उपयोग किया। उन्होंने 14 विशिष्ट पेप्टाइड अनुक्रमों को पाया।

इसके बाद उन्होंने कंप्यूटर सिमुलेशन (मॉलिक्यूलर डॉकिंग) का उपयोग करके यह देखा कि ये पेप्टाइड्स ACE और DPP-IV एंजाइमों के "ताले" में कैसे फिट होते हैं।

• ACE के लिए: पेप्टाइड VFPLR मुख्य सितारा था, जिसकी अनुमानित बाइंडिंग स्ट्रेंथ −9.2 kcal/mol थी। यह इतनी सटीकता से फिट हुआ कि इसने एंजाइम के भीतर एक जिंक आयन को भी पकड़ लिया, जिससे लॉक प्रभावी रूप से जाम हो गया। LAFPG (−8.8 kcal/mol) और RQSHF (−8.5 kcal/mol) भी मजबूत दावेदार थे।
• DPP-IV के लिए: पेप्टाइड्स SPGAG (−7.6 kcal/mol) और IAPLP (−7.3 kcal/mol) ने सबसे अच्छा फिट दिखाया।

अध्ययन ने यह भी देखा कि निषेध (inhibition) कैसे काम करता है। यह पता चला कि CPI-ALC मिश्रण एक "मिक्स्ड-टाइप" अवरोधक के रूप में कार्य करता है। कल्पना कीजिए कि एक ट्रैफिक पुलिस वाला न केवल कार के सामने खड़ा होता है (सक्रिय साइट को रोकना) बल्कि ड्राइवर को दूर से ही धीमा होने का इशारा भी करता है (एंजाइम के आकार को बदलना)। यह दोहरी क्रिया इसे एक बहुत ही प्रभावी ब्लॉकर बनाती है।

वास्तविकता की जाँच

हालांकि परिणाम रोमांचक हैं, लेखक अपने पैर जमीन पर रखने में सावधानी बरतते हैं। वे बताते हैं कि ये परीक्षण एक लैब डिश (in vitro) में किए गए थे, न कि जीवित शरीर के अंदर। "IC₅₀" मान, हालांकि प्रभावशाली हैं, अभी भी सिंथेटिक दवा कैप्टोप्रिल (captopril) की तुलना में लगभग 300 गुना कमजोर हैं। इसका मतलब है कि ये चने के पेप्टाइड्स आपातकालीन दवा का विकल्प नहीं हैं, बल्कि दीर्घकालिक आहार संबंधी सहायता के लिए एक संभावित उपकरण हैं।

इसके अलावा, अध्ययन में यह परीक्षण नहीं किया गया कि क्या ये पेप्टाइड्स पेट के कठोर एसिड में जीवित रहते हैं या क्या वे वास्तव में रक्तप्रवाह में जाने के लिए आंत की दीवार को पार कर सकते हैं। लेखक सुझाव देते हैं कि भविष्य के शोध को पाचन का अनुकरण करने और इन पेप्टाइड्स को जानवरों में परीक्षण करने की आवश्यकता है ताकि यह देखा जा सके कि वे वास्तविक जीवन में कैसे काम करते हैं। वे यह भी नोट करते हैं कि उन्होंने केवल चने की एक विशिष्ट किस्म का परीक्षण किया है, इसलिए अन्य प्रकार अलग तरह से व्यवहार कर सकते हैं।

निचोड़

यह अध्ययन चने से बायोएक्टिव पेप्टाइड्स बनाने के लिए पांच एंजाइमों की पहली स्पष्ट, आमने-सामने की तुलना प्रदान करता है। यह पुष्टि करता है कि Alcalase, विशिष्ट परिस्थितियों (3.2% एंजाइम, 52°C, 180 मिनट) के तहत, इस काम के लिए सबसे अच्छा उपकरण है, जो छोटे पेप्टाइड्स (मुख्य रूप से 1 kDa से कम) का मिश्रण बनाता है जो रक्तचाप, रक्त शर्करा और ऑक्सीडेटिव तनाव को एक साथ लक्षित कर सकते हैं। हालांकि हम अपनी दवाइयों को छोड़कर अभी चने के सूप पर पूरी तरह निर्भर होने के लिए तैयार नहीं हैं, फिर भी यह शोध नए, प्राकृतिक कार्यात्मक खाद्य पदार्थों बनाने का मार्ग प्रशस्त करता है जो हमारे आंतरिक शहर के ट्रैफिक को सुचारू रूप से चलाने में मदद कर सकते हैं।